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细胞核的分离与鉴定实验报告 　　医学细胞生物学设计型实验设计报告　　姓名：李飘班级：K—10班学号：10XX1004评分　　【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定　　【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的　　细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。　　细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。　　【实验步骤】：　　1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。　　2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。　　3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37℃的CB溶液。　　4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。　　5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。　　7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。　　8．染色：将制作好的涂片放入%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。　　【注意事项】：　　1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37℃。　　2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。　　3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。　　4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。　　【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性　　蛋白，即细胞核。　　医学细胞生物学设计型实验设计报告　　班级10级k-7班评分　　实验项目：细胞核的分离与鉴定　　实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。　　2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条件下进行离心分离，然后分析鉴定。　　3、匀浆是指在低温条件下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。　　实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。　　2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。　　3、匀浆：加油8ml预冷的/L蔗糖/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。　　4、过滤：用8层纱布　　过滤匀浆液于离心管中。　　5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心15min，取上清液于另一离心管中。　　6、涂片：取上清液制一张涂片。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片，自然干燥。　　7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液，染色5到7分钟。　　8、洗涤：冲去染液，晾干。　　9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。　　注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。　　2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。　　3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。　　预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。　　实验用品：材料：小白鼠肝脏。　　试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖/L氯化钙溶液、　　1%甲苯胺兰染液。　　仪器设备：显微镜、普通离心机、天平、离心管、滴管、　　玻璃漏斗、量筒、25ml烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、伯乐匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。