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评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响 Stephan M. Koza、Corey E. Reed和Weibin Chen 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 简介 ■■ 了解LC系统扩散的测定 蛋白的体积排阻色谱(SEC)分析是评估生物治疗性重组蛋白和肽类产品中非共 ■■ 教学式系统展示LC系统扩散对蛋白质SEC 价蛋白聚集体(高分子量物质[HMWS])时所采用的主要方法1。在应用纪要《LC系 统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响：基于方法选择最佳色谱柱规格》( 分离的影响 部件号：720006336ZH)中，我们展示了对SEC法分析单克隆抗体(mAb) HMWS ■■ 指导用户根据所使用的LC系统和分析方法 和片段(LMWS)的深入评估结果，以及柱外扩散对上述分离的影响。本应用纪要 要求(包括分离度、灵敏度、重现性和可转换 是该出版物的姊妹篇，旨在更加详细地介绍柱外扩散和SEC色谱柱选择。我们 性)选择最佳的SEC色谱柱配置 还提供额外的指导信息和数据，用以辅助展示柱外扩散的测定以及柱外扩散对 SEC分析质量的影响。因此，我们在两篇应用纪要中展示了一些相同的数据和图 片，目的是使这两篇应用纪要能够单独用于阅读和引用。 柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现 象。因此，当扩散体积按分离峰的体积成比例增加时，SEC分离的分离度将随之 降低。 简要回顾蛋白质SEC分离方法的历史，您就能明白为什么近年来LC系统扩散对 SEC分离质量的影响越来越大。1977年，日本东曹株式会社推出了一种二醇基键 合硅胶基质TSKgel® SW 系列SEC蛋白分析专用柱，其填料粒径为10~13 µm。该 SW系列色谱柱和东曹在10年后推出的5~8 µm粒径SWXL系列色谱柱通常采用 内径为7.5 mm(或更大)，柱长30 cm的色谱柱硬件进行填充。 沃特世解决方案 ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio系统 ACQUITY Arc™ Bio系统 Alliance™ HPLC系统 ACQUITY UPLC BEH SEC蛋白分析专用柱, 200Å, 1.7 µm XBridge™ BEH SEC蛋白分析专用柱, 200Å, 3.5 µm Waters™ BEH200 SEC蛋白混标 关键词 体积排阻、系统扩散、UPLC、UHPLC、HPLC、 蛋白质 1 使用这些色谱柱所得到的峰体积足够大，因此分离效率显著，柱外 这导致这些现代色谱柱产生的峰体积大幅减少，从而使典型HPLC 扩散不会对其造成显著影响。虽然以往这些TSKgel SW和SWXL 系统中的柱外扩散相对于生成的SEC峰体积而言非常大，以致出 色谱柱是分析生物治疗性蛋白质聚集体时常用的色谱柱，但近年 现峰分离度大幅下降的现象2。 来随着样品通量的要求越来越高，有