抗菌肽对D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭保护作用的研究-传染病学专业毕业论文.docxVIP

抗菌肽对 D- 抗菌肽对 D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭保护作用的研究 中文摘要 抗菌肽对 D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭 保护作用的研究 中文摘要 研究背景及目的 肝衰竭是由多种因素引起的肝脏合成、解毒、排泄和生物转化 等功能发生严重障碍，导致肝脏功能严重失代偿，出现以黄疸、凝血机制障碍、肝性 脑病以及腹水等为主要表现的一组临床症候群。肝衰竭发病急、进展快、并发症多、 预后差、死亡率高。目前，尽管原位肝脏移植和人工肝支持治疗可作为肝功能衰竭治 疗的有效手段，但前者供体肝缺乏，且存在手术复杂、术后可能发生排斥反应等缺点， 使得这一治疗措施难以广泛推广；后者也面临血浆来源紧张，对晚期肝功能衰竭治疗 效果差等问题。寻找新的肝衰竭治疗手段势在必行。以肠源性内毒素血症为核心的继 发性肝脏损伤是导致肝衰竭病情迅速进展的重要原因。因此，探寻以中和内毒素为目 标的治疗手段。以阻断肝衰竭患者内毒素血症导致的继发打击成为目前肝衰竭研究的 热点。 阳离子抗菌肽（cationicantimicrobial peptides,AMPs）是一类带净正电荷的两性小 分子多肽，在生物体内广泛存在。研究发现，AMPs具有强大的中和内毒素的能力， 并因此抑制炎症因子的释放。基于此，本研究通过体外实验及小鼠肝衰竭动物模型探 讨AMPs治疗肝衰竭的可行性。 方法 我们首先在体外研究不同 AMPs 中和内毒素的效率，用鲎试验（LAL assay）检测四种 AMPs（PY、Ts、LL-37、Th）中和内毒素作用；采用 CCK-8 法检 测四种 AMPs 对 RAW264.7 的毒性作用；用体外溶血实验评价四种 AMPs 的溶血活性； 流式细胞技术检测 AMPs 对肝细胞凋亡率的影响；构建 D-氨基半乳糖联合内毒素诱 导小鼠急性肝衰竭模型，观察 AMPs 对模型小鼠存活率的影响，观察各组肝脏病理学 变化，并通过免疫组化、Western blot 检测其肝组织中凋亡相关蛋白 Caspase-3 的表达。 结果 1. 中和内毒素作用：PY、Ts、LL-37、Th 均有较强的中和内毒素作用， 并且有一定的剂量关系，随着 AMPs 浓度的升高，中和率也明显升高；PY 及 LL-37 有更强的中和能力；进一步组间比较，四种 AMPs 不同浓度间存在差异（P0.05）， 且四种 AMPs 分别在 1、10、100umol/L 中任意一个浓度比较，差异均有统计学意义 I PAGE PAGE IV PAGE III PAGE III 中文摘要 抗菌肽对 D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭保护作用的研究 （P0.05）。 2. 细胞毒性研究：Ts、Th 均有微弱的细胞毒性，且没有呈现明显的剂量关系。 LL-37 有一定的剂量关系，只有在相对较高的浓度(100umol/L)才表现明显的细胞毒 性。PY 对细胞的毒性有明显地剂量依赖性，在高浓度（40umol/L）时，有较强的细 胞毒性，而在低浓度时只有较弱的细胞毒性。在浓度低于 10umol/L 时，四组均有较 高的细胞存活率。进一步组间比较，PY、Ts、LL-37、Th 不同浓度间存在差异，且 差异有统计学意义（P0.05），且随着浓度的降低，AMPs 的细胞毒性逐步降低；四 种 AMPs 在任意一个浓度比较，差异均有统计学意义（P0.05）。 3. 溶血活性研究：四种 AMPs 浓度低于 40umol/L 时，均表现轻微的溶血活性， 在相对较高的浓度(80umol/L)，PY、Th、Ts 仍表现微弱的溶血活性，而 LL-37 则表 现明显的溶血活性，进一步组间比较，四种 AMPs 在不同浓度间存在差异，且差异有 统计学意义（P0.05），且随着浓度的降低，AMPs 的溶血活性逐步降低；四种 AMPs 分别在任意一个浓度比较，差异均有统计学意义（P0.05）。 4. 对小鼠原代肝细胞凋亡的保护作用：与阳性对照组相比，四种 AMPs 均对肝 细胞凋亡有抑制作用，其中 PY 的抑制作用最为明显；四种 AMPs 分别与阳性对照组 比较，差异均有统计学意义（P0.05）；相同浓度四种 AMPs 对细胞凋亡的抑制能力 为：PYLL-37TsTh；Ts、Th、LL-37 的细胞凋亡率均为在 80umol/L 时更低；而 PY 在 40umol/L 时细胞凋亡率更低。 5. 小鼠肝衰竭模型存活率的研究：PY、Ts、LL-37、Th 对肝衰竭模型小鼠存活 率有一定影响，且存在剂量关系；中等剂量的 PY、LL-37（PY 3、LL-37 3）小鼠的 存活率较高；Ts 、Th 在 1.5-6mg/kg 范围内，随剂量升高，存活率升高。 6. 组织学检测：HE 染色：各组 AMPs 分别与对照组比较，肝组织损伤程度