鮸鱼和赤点石斑鱼精子超低温冷冻保存研究-中药学专业毕业论文.docxVIP

摘要 摘要 1 Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． 2 第一章前言 ．4 1．1我国海洋鱼类资源近况 ．．4 1．2超低温泠冻生物学的应用 ．4 1．3实验用海洋经济鱼种简介 ．5 1．3．1娩鱼 5 1．3．2赤点石斑鱼 5 1．4本文研究内容 ．．6 1．4．1娩鱼精子超低温洽冻保存条件的研究 6 1．4．2赤点石斑鱼精子超低温冷冻保存的研究 6 第二章娩鱼精子超低温冷冻保存条件研究 ．．7 2．1材料与方法 7 2 1．1亲鱼管理 7 2．1．2精子的采集和质量控制 7 2．1．3精子活力及运动持续时间的测定 7 2．1．4精子悬液的制备 8 2．1．5精子洽冻程序筛选及解冻 ．．8 2．1．6数据分析 8 2．2结果 ．8 2．2．1抗冻保护剂的影响 8 2．3分析与讨论 2．3分析与讨论 ．16 第三章赤点石斑鱼精子超低温泠冻保存研究 l 7 3．1材料与方法 17 3．1．1亲鱼管理 ．．1 7 3．1．2精子采集和质量控制 l 8 3．1．3精子活力和运动持续时间的检测 18 3．1．4精子激活剂的筛选 19 3．1．5精子超低温泠冻方案的筛选 ．．19 3．1．6精子洽冻降温速率的筛选 ．．19 3．1．7胆固醇转入对精子冷冻效果的影响 20 3．1．8精子洽冻前后膜脂分析 ．20 3．1．9洽冻前后精子超微结构变化 2 1 3．1．10人工受精中精卵比的筛选 22 3．1．11数据分析与统计 22 3．2结果 ．22 3．2．1亲鱼管理和精子质量控制 22 3．2．2精子激活剂的筛选 ．23 3．2．3精子冷冻方案的筛选 ．24 3．2．4精子洽冻速率的筛选 25 3．2．5胆固醇转入对精子泠冻效果的影响 ．．26 3．2．6精子泠冻前后膜脂分析 27 精子超微结构变化 精子超微结构变化 ．29 中精卵比的筛选 ．30 ．3l ．34 ．．38 ． ． ．． ．39 ．．45 ． ． ． ．．47 文缩略语对照表中文说明 文缩略语对照表 中文说明 solution Hank’S平衡盐溶液 balanced salt solution 无钙离子Hank’S平衡盐 溶液 二甲基亚砜 甘油 葡萄糖 甲醇 EG Ethylene glycol 乙二醇 PG Propylene glycol 丙二醇 温州医学院硕E学位论文鲵鱼和赤点石斑鱼精子超低温冷冻保存研究 温州医学院硕E学位论文 鲵鱼和赤点石斑鱼精子超低温冷冻保存研究 摘要 精子超低温冷冻作为一种可靠、经济、高效的手段可以将优良海水经济鱼 种精子长期保存在．198。C的低温中。不仅可以通过这一技术保存濒危和良种鱼类 的种质资源，而且可以解决生殖隔离和雌、雄鱼成熟不同步的养殖难题。本研究 主要内容为：(1)筛选了兢鱼精子超低温冷冻中的抗冻保护剂种类、浓度以及降 温速率；(2)筛选了赤点石斑鱼精子冷冻的基本方案，并对其进行优化。 航鱼是我国水产养殖中的良种鱼类，已有对其精子细胞的超低温冷冻保存 技术的初步研究。为了进一步优化娩鱼精子超低温冷冻保存条件，本实验采集6 条性成熟娩鱼精子细胞，稀释后加入四种抗冻保护N-DMSO、Gly、EG、PG。 这四种抗冻保护剂分为六种浓度：5％、10％、15％、20％、25％、30％。每种处 理后的精子分别使用置于液氮面上四种高度进行降温：lcm、3．4cm、5cm、7cm。 经过24h的冷冻保存，检测不同处理组冷冻复苏后精子活力和运动持续时间。实 验结果显示觎鱼精子抗冻保护剂的最适浓度范围为5．15％。用15％EG作为抗冻 保护剂，以距离液氮面7cm的高度进行降温精子冻后同时具有较好的活力和运 动持续时间，分别为(81 4-5．57％)和(277 4-46．36s)。 赤点石斑鱼在亚洲东部和南部是一种重要的水产养殖经济鱼类，也是世界自 然联盟(IUCN)红色名单中的濒危鱼种。它是一种雌雄同体，雌性先熟的鱼类， 要经过很长一段时间才能发育为成熟雄性。而雌、雄鱼成熟不同步成为该鱼种人 工养殖上的难题。超低温冷冻可以将过剩的雄鱼精子细胞进行保存，保证雌鱼受 精能够随时进行。本实验首次对赤点石斑鱼精子超低温冷冻进行研究，分别用不 同渗透压的C．F HBSS、NaCI、Glu和新鲜海水对精子进行激活，发现用 1100mOsm／kg Glu激活后精子活力达到(89 4-2％)。对比前人建立的两种石斑鱼 超低温冷冻保存方案，结果显示10％DMSO+10mg／ml BSA作为抗冻保护剂可以 使赤点石斑鱼精子冻后具有最高活力(70 4-4％)。进一步研究降温速率发现使用 较快的610C／min进行降温可