马铃薯块茎抗低温糖化相关基因差减文库的构建-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要马铃薯是全球第四大粮食作物，亦是一种重要的高产经济作物。随着马铃薯加 摘要 马铃薯是全球第四大粮食作物，亦是一种重要的高产经济作物。随着马铃薯加 工产业(炸片、炸条)的迅猛发展，加工型马铃薯品种的需求量逐年递增。为了防 止马铃薯块茎在收获后的发芽、缩水、病虫害和腐烂等，往往将块茎进行低温储藏 (低于10(2)，但是这种方法会导致马铃薯块茎中的淀粉降解，还原糖含量急剧上 升，这一现象被称之为“低温糖化”。在油炸加工过程中，还原糖与氮化合物的a．氨 基酸会发生“美拉德反应”，生成“类黑蛋白素”，使薯片色泽变暗，味道变苦，令消 费者难以接受。而有些马铃薯野生种却表现出耐低温糖化的特性。现今关于低温糖 化现象的生理生化机制并不十分清楚，与耐低温糖化相关的基因及其表达调控研究 亦十分有限。本研究以耐低温糖化的野生种(s berthaultii)和不耐低温糖化的栽培 品种“鄂马铃薯1号”为材料，通过构建差减文库的方法，筛选出与耐低温糖化相关 的基因，为揭示马铃薯块茎耐低温糖化机理奠定基础。取得的主要研究结果如下： 1．通过改进前人的变性液配方，配合本实验室的抽提方法，建立了一个改良的适 用于多淀粉块茎、块根组织RNA抽提的方法。本方法结合了赫酸胍和尿素两种 变性剂，加上高浓度的p·巯基乙醇，有效解决了内源RNase造成的总RNA降解 以及多酚氧化污染的问题。高浓度的变性剂和样品冻溶后迅速JJn*的苯酚／氯仿／ 异戊醇，抑制了马铃薯块茎中淀粉的吸水膨胀作用，总RNA初步沉淀后用DEPC 处理的水重新溶解再进行蛋白质的分离，更加有效的去除了蛋白质和变性液的 污染。与以前的抽提方法比较，本方法经济、简单、有效，提取的总RNA可用 于后续的各种分子生物学操作。 2．采用抑制差减杂交技术(SSH)，构建了以野生种材料(CW2，1)分别在4C(Tester) 和20℃(Driverl)条件下处理5d的表达基因差减文库(CW)；以CW2．1(Tester) 和E1(Driver2)为材料，在4C条件下处理5d的表达基因差异文库(CE)。CW 文库库容为1468个克隆，CE文库为1372个克隆。 3．应用反向Northern技术对文库进行了初步筛选，杂交信号利用凝胶分析软件 “Gel-ProAnalyzer 3．1”进行结果分析，根据表达信号强弱，从文库CW中挑选了 表达强度大于5倍的53个克隆，文库CE中挑选了表达强度大于3倍的40个克 隆进行测序与分析，经GenBank中同源性检索分析后，分别得到了29和31个 基因的EST片段。生物信息比对结果显示，半数左右的片段为未知功能基因， 在文库CW和CE分别占57％和49％。已知功能的序列在分析的EST中包括代 谢相关、抗逆相关、转录相关、信号传导、能量代谢和蛋白合成。 4，采用RT-PCR途径，对3一磷酸甘油醛脱氢酶、腺苷甲硫氨酸脱羧酶、延伸因子 1-alpha，14—3—3蛋白、硫氧还蛋白和磷酸甘油酸变位酶等6个基因进行了分析， 结果显示，3-磷酸甘油醛、腺苷甲硫氨酸脱羧酶、磷酸甘油酸变位酶和硫氧还蛋 自在 CW2．1块茎4C储藏后的表达强度高于该材料20℃储藏和“鄂马铃薯l 4 号”块茎4C储藏；14·3-3蛋白在CW2．1块茎中无论在4C储藏还是20℃储藏均 号”块茎4C储藏；14·3-3蛋白在CW2．1块茎中无论在4C储藏还是20℃储藏均 高于“鄂马铃薯1号”块茎4℃储藏，但在CW2．1的4C储藏表达量略高于20C 储藏；延伸因子1-alpha在两个材料40储藏的块茎中表达强度显著高于CW2．1 块茎的20C储藏。 5．文库的初步筛选分析表明，差减文库的克隆确为与耐低温糖化相关的差异基因。 构建的两个文库为后续的马铃薯块茎耐低温糖化机理的研究提供了基础以及技 术平台。 关键词：马铃薯，低温糖化，差减文库，总KNA抽提 ABSTRACTPotato(Solanum ABSTRACT Potato(Solanum tuberosum L)is not only the fourth food crop but also an important cash crop in the world．In order to prevent the tubers from sprouting，shrinking， pathogen infection and rotting during storage，tlley are usually stored under low temperature condition,which causes breakdown of starch and accumulation of reducing sugars，a complex phenomenon cal