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第二章 环境检测微生物技术 第二章 环境检测微生物技术 环境检测是以分析化学、物理和物理化学测定、生物指示及某些高新技术为基础，对环境中的化学污染物及物理污染（噪声、光、热、电磁辐射、放射性等）和生物污染因素（病原体等）进行现场、长期的、连续的监视和测定，并且研究它们对环境质量的影响。 环境质量的生物检测是环境检测中重要的组成部分，它是以生态学理论为基础，利用环境中生命表现形式的各级水平（分子、细胞、组织、水平、种群、群落和生态系统）对环境污染或变化所产生的反应，来阐述环境污染状况，从生物学角度为环境质量的检测和评价、污染控制、环境管理等提供重要依据。 第二章 环境检测微生物技术 传统的微生物检测是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。 细菌总数（倾注平板培养法、平板表面涂布培养法）而空气中用平板暴露沉降法和仪器法。单位cfu/ml cfu/g cfu指单位体积、单位表面积或单位质量检样中的菌落形成单位。 第二章 环境检测微生物技术 总大肠菌群是一群能在37℃、24h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 多管发酵法又称最大可能数法（MPN）。就是将样品用无菌水进行系列稀释，取一定稀释度的稀释液(一般要做5个稀释度)接种于培养基中，培养一定时间，观察各稀释度的生长情况。根据各稀释度的生长管数，以统计学的方法求出样品所含微生物的数量(可以从一统计表中查出)，MPN法一般采用3管或5管法。该方法可以用于样品中诸如好氧异养菌总量、厌氧异养菌总数、硝化反硝化菌总量、硫酸盐还原菌总量等的定量测定。 膜滤法 第二章 环境检测微生物技术 粪便污染指示菌： 理想条件为： 1 是人畜粪便中的正常菌，且数量较粪便中其他菌为多； 2 受污染环境中可检出，而未污染环境无该菌存在； 3 排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长； 4 对消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病菌； 5 检出与鉴定方法比较简便迅速 。 第一节 分子水平的微生物检测技术 目前研究较多的是应用核酸探针、PCR技术等生物高技术进行环境检测。 一、核酸杂交技术 探针是能与特定核苷酸序列互补、已经标记的DNA（或RNA）片段，可以检测样品中是否存在待测的特异核酸序列(往往是某种微生物的保守性片段）。 杂交是样品中提取的核酸分子与探针互补序列间的配对过程，杂交结果可以通过探针的放射性或非放射性标记被灵敏地检测。 一、核酸杂交技术 可以获得众多传统技术难以培养或鉴定的自然种群的DNA信息。 跟踪环境中特定的基因及其宿主微生物； 可以在同一时间研究多种的微生物； 研究基因组的组织上的变化以及自然界中基因表达的调控等； 利用DNA和RNA探针检测、跟踪环境中特定的基因或DNA序列及其宿主微生物。 当前的热点是利用高度特异的寡聚核苷酸探针直接与细胞内的、或从细胞中提取出来的rRNA以及从rRNA经反转录而来的rDNA杂交，从而检测到混合样品中特定微生物的存在。 一、核酸杂交技术 不同的微生物其ｒRNA基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，但是它们本身又具有高度的保守性，形象地说，它们可以作为生物进化史的计时器，其序列的相似程度可以反映出它们在系统发育上的关系。 早在十多年前 ,最小的ｒRNA分子—5ＳｒRNA就已被用于分析一些简单的微生物群落的组成。不同微生物类群的 5ＳｒRNA分子被直接从混合样品中提取出来 ,再通过电泳分离 ,最后经过测序及序列的比较分析就可以知道有关的微生物在系统发育上的相对位置。然而 ,大小仅 120个左右核苷酸的 5SｒRNA分子携有的信息量十分有限 ,而且电泳分离的步骤限制了它在复杂的微生物生态系统中的应用。随后 ,有关的研究重点被集中于发展分子量更大、携带信息量更多的ｒRNA分子—其中主要是小核糖体亚单位ｒRNA分子 (原核生物的 16SｒRNA和真核生物的 18SｒRNA)—的分析方法上。 一、核酸杂交技术 16SrRNA分子约有 1500个核苷酸，当其全序列或大部分序列 (至少1000个核苷酸以上 )被分析时，就可得到有关微生物在系统发育方面的足够信息并因此知道它们在系统发育上的位置，从而鉴定各种微生物。 而利用基于这些信息而设计的寡核苷酸探针既可以直接在环境样品上进行原位杂交，或与浓缩富集的样品进行全细胞杂交，也可以与从环境样品中提取出的DNA或ｒRNA进行定量点渍杂交，或与rDNA的扩增产物杂交，从而可以得到特定微生物在环境中的存在、分布和丰度以及整个微生物群落的组成、结构及其多样性等全面的信息。到目前为止，利用此项技术已对众多的生态样品进行了分析，并且发现了许多新的微生物种。 一、核酸