质粒dna的鉴定实验报告.docx

质粒dna的鉴定实验报告 　　1．实验目的：　　通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；　　通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；　　2．实验材料及用品　　实验仪器：　　恒温培养箱、恒温摇床、高速离心机、漩涡振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、微量加样器、烧杯、量筒、玻璃棒、微波炉、天平、电泳梳子、电泳槽、电泳器、紫外灯　　3）、材料与试剂：　　①溶液I：　　50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷Tris-HCl；10mmol/L乙二胺四乙酸　　溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。　　②溶液Ⅱ：新鲜配制，等体积混合　　/LNaOH；1%SDS注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。　　③溶液III　　④TE液缓冲液：10mmol/LTris-HCl；1mmol/LEDTA　　⑤70%乙醇；　　⑥平衡酚：氯仿1：1：　　将量取25mlTris-HCl平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。　　⑦LB培养基：　　胰化蛋白胨10g　　酵母提取物5g　　NaCl15g　　pH　　⑧琼脂糖；　　⑨1liter5×TBE备用溶液：　　54gtrisbase，硼酸，20mlmol/LEDTA,pH；　　⑩6×凝胶加样缓冲液：　　%溴酚蓝，40%蔗糖；　　另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂　　实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。　　3．实验原理：　　1）质粒DNA的提取：　　关于质粒：　　质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。　　一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：　　①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；　　②收集和裂解细菌；　　③分离和纯化质粒DNA。　　分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。　　碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：　　碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。　　在pH值介于~这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。　　2）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：　　关于电泳技术：　　电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。　　琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。一般琼脂糖胶浓度在％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。　　琼脂糖凝胶电泳条带的观察：　　通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳　　时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。　　质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：　　DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶