绵羊布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞过程的荧光表征与分析-遗传学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 The Fluorescent characterization and analysis of Macrophages infected with GFP transgene B.melitensis A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Nature Science By Ma Hui (Genetics) Dissertation Supervisor:Prof. Gao Jianfeng June, 2014 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名 : 马i 时间:)Rt伊年 b 月 4 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务.有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 名:五慧 师签名乡4主  时间: )01伊年 b月 日 时间tXbl{/年 6 月￠日 摘要 目的：构建稳定表达 GFP 的整合型重组布鲁氏菌 16M 和 M5（以下简称 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5）；比较 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 与正常布鲁氏菌 16M 和 M5 在巨噬细胞中 的存活能力，证明 GFP 基因的转入不会影响后续实验的进行。分析 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 进入细胞后与宿主细胞中的溶酶体、内质网、高尔基体结合产生的荧光强度；分 析 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 侵染小鼠巨噬细胞的数量；对侵染初期与胞内溶酶体、内 质网、高尔基体结合的时间测定，为布鲁氏菌在细胞内的生存繁殖及其分子机制研究提 供理论参考。 方法:将 pMC-221-GFP 载体电转化进入布鲁氏菌 16M 和 M5 感受态细胞，稳定传代后获 得 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5。将 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 与正常布鲁氏菌 16M 和 M5 培养至对数期收集菌体，用麦氏比浊法至所需浓度，按照细菌和细胞比例为 100：1 进 行侵染，利用平板计数法检测其在胞内的存活能力；激光共聚焦显微镜观察胞内 GFP- 布鲁氏菌与溶酶体，内质网和高尔基体之间的结合，并检测出 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 与溶酶体、内质网和高尔基体结合后产生的荧光强度；用流式细胞仪测定侵染初期 GFP-布鲁氏菌进入细胞及与胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合的时间。 结果：(1)成功获得整合重组型 GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5。（2）GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 与正常布鲁氏菌 16M 和 M5 比较发现在小鼠巨噬细胞中的存活能力并无差别。（2） GFP-布鲁氏菌 16M 与溶酶体、内质网（ER）和高尔基体结合初期产生的荧光强度与布 鲁氏菌 M5 相比较并无明显差异。（3）GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 侵染初期小鼠巨噬细 胞产生的 GFP+巨噬细胞没有明显区别，但是后期差距逐渐明显。（4）GFP-布鲁氏菌 16M 和 M5 侵染初期 10 min 进入巨噬细胞，1.5 h 布鲁氏菌到达溶酶体，2 h 布鲁氏菌同时到 达内质网（ER）和高尔基体。 结论：（1）GFP 基因的整合重组并不会影响布鲁氏菌 16M 和 M5 的生物特性。（2）GFP- 布鲁氏菌 16M 和 M5 在侵染初期结合宿主细胞及胞内溶酶体、内质网和高尔基体的时间 相同，这可能与二者同属布鲁氏菌Ⅰ型标准菌株有关。（3）GFP-布鲁氏菌到达内质网和 高尔基体的时间相同，这可能与内质网和高尔基体之间的膜转移蛋白有关。（4）虽然布 鲁氏菌 16M 和 M5 在侵染初期荧光强度和 GFP+巨噬细胞数量上没有显著差别，但是胞 内存活实验结果却恰恰相反。由此认为布鲁氏菌 16M 和 M5 进入小鼠巨噬细胞和达到溶 酶体、内质网和高尔基体的能力没有区别，两者的差别还是在于胞内的生存能力，同样 认为该能力也是其致病性的关键因素。 关键词：布鲁氏菌 16M；布鲁氏菌 M5；绿色荧光