马氏珠母贝壳基质蛋白基因的克隆和表达模式研究-海洋生物学专业毕业论文.docxVIP

广东海洋大学硕士学位论文 广东海洋大学硕士学位论文 马氏珠母贝壳基质蛋白基因的克隆和表达模式研究 摘 要 马氏珠母贝是最重要的海水珍珠贝，然而至今还不能从分子水平彻底阐明珍珠的形 成。珍珠的形成属于生物矿化过程（biomineralization），是由一系列基质蛋白指导 CaCO3 结晶的过程，但关于它们在分子水平上的作用机理，多个基质蛋白相互之间的关系，与 其他物种相关蛋白之间的进化关系，表达水平的调控，目前的研究成果都无法给与充分 的解释。本实验主要完成 2 方面的工作：（1）考察多种环境因子对马氏珠母贝一种重 要基质蛋白基因表达模式的影响；（2）发现一种新的壳基质蛋白，并进一步预测和分 析其结构和功能。我们拟通过开展这样的工作，为研究贝壳和珍珠的形成机理做出初步 的研究。 利用 5’RACE 技术，克隆出一种马氏珠母贝壳基质蛋白基因的 cDNA 全长，通过预 测该蛋白质序列，发现其 N 端含有一段 19 个氨基酸组成的信号肽，含有典型的 Gly-rich 区和 C 端 RKKKY 保守序列，同源性分析表明，这是一个新发现的 Shematrin 家族成员， 和 Shematrin-2 同属一个亚家族，故命名为 Shematrin-2β。进一步的比对发现，Shematrin-2β 和 MSI7 有着局部高度匹配的区域，推测二者在进化上有着特殊的关系。氨基酸组分分 析表明，Shematrin-2β 可能会赋予壳和珍珠特殊的机械属性，参与生物矿化过程中支架 蛋白的构建，同时还能够介导其他蛋白质参与矿化过程。RT-PCR 显示，Shematrin-2β 基因在外套膜边缘和缘膜处均有表达，暗示该基质蛋白可能在珍珠层和棱柱层的构建中 均有作用。这一研究成果，填补了 Shematrin 家族的空缺，对进一步研究该家族与生物 矿化的关系有着一定的意义。 采用中心复合设计等方法，考察温度和盐度，Ca2+和 Mg2+对马氏珠母贝红壳色选育 系 Nacrein 基因表达量的联合影响。结果显示：（1）温度和盐度的一次效应对 Nacrein 基因表达有显著影响(P0.05)，二次效应有极显著影响(P0.01)，但二者间互作效应不显 著(P0.05)。通过对模型的优化，得到的最优表达温盐组合为 26.1℃，30.6ppt，此时相 对表达量最大为 0.509，模型满意度为 100%。 通过设计一组 Ca2+浓度梯度和 Mg2+浓度梯度，考察 Ca2+和 Mg2+对马氏珠母贝红壳 色选育系 Nacrein 基因表达量的联合影响。结果显示，基因表达量随着 Ca2+浓度的增加 而显著升高，Ca2+浓度的一次效应和二次效应极显著（P＜0.01）。在上述处理的基础上， 每组加入等量的 Mg2+，结果发现，Mg2+处理前后基因表达量也存在着显著差异，Mg2+ 浓度的一次效应极显著。但二者的互作效应不显著（P＞0.05）。这表明，一定浓度范 围内，Ca2+和 Mg2+对 Nacrein 基因的表达有着明显地促进作用，并且存在着一个最适 Ca2+ I 浓度。 关键词：马氏珠母贝，壳基质蛋白，温度和盐度，Ca2+和 Mg2+，Shematrin 家族 II Cloning and expression pattern research of shell matrxi protein gene in Pinctada fucata(Dunker) Abstract Pinctada fucata is one of the most important sea pearl oyster , however, has not completely elucidated the formation of pearls at molecular level . The process of Pearls formation are called biomineralization ,which composed of a series of process that guide the crystallizetion of CaCO3 by a serise of matrix proteins , but on their mechanism of action at the molecular level , the relationship among multiple matrix proteins , the relationships with theri counterpart in other closely related species, and the regulation for expression level et al , the curren