绿豆CHI与CHS基因的克隆与表达研究-生物学专业毕业论文.docxVIP

The Thesis of FAFU’s Master Student Cloning and expression study of CHI gene and CHS gene in Vigna radiate L. Degree category: Science The name of discipline: Biology The name of major: Biochemistry and Molecular Biology Research Field: Biochemistry and Molecular Biology of Plant Student name: Ke Lanlan Supervisor: Professor Pan Daren Submitted time: March, 2015 Fujian Agriculture and Forestry University(FAFU) 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 □ 不保密，本论文属于不保密。 □ 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 目 录 摘要 I Abstract III 1 文献综述1 1.1 绿豆概况1 1.1.1 绿豆的药用价值研究1 1.1.2 绿豆种质资源的研究进展2 1.1.3 绿豆基因克隆研究现状3 1.2 查尔酮异构酶研究进展4 1.2.1 查尔酮异构酶的类型特点及催化过程 4 1.2.2 查尔酮异构酶基因研究进展5 1.2.3 查尔酮异构酶基因在基因工程中的应用 7 1.3 查尔酮合成酶研究进展8 1.3.1 查尔酮合成酶的结构及催化机制8 1.3.2 查尔酮合成酶基因研究进展9 1.3.3 查尔酮合成酶基因的功能及应用 11 1.4 获得目的基因的常用方法概述12 1.5 转基因大豆研究方法概述13 1.6 本实验研究目的与意义15 2 材料与方法16 2.1 材料16 2.1.1 植物材料16 2.1.2 菌株及质粒16 2.1.3 药品16 2.1.4 培养基16 2.1.5 主要仪器设备17 2.2 方法17 2.2.1 绿豆叶片 cDNA 第一链的获得 17 2.2.2 绿豆查尔酮异构酶基因的克隆17 绿豆 CHI 基因片段的克隆 17 绿豆 CHI 基因片段的回收、连接及转化 18 绿豆 CHI 基因的拼接及验证 19 2.2.3 绿豆查尔酮合成酶基因的克隆19 绿豆 CHS 的获得 19 绿豆 CHS 基因的回收、连接、转化及测序 20 绿豆 CHS 基因的验证 20 2.2.4 植物表达载体 pFGC5941-CHI 的构建及农杆菌转化 20 2.2.5 农杆菌介导法转基因烟草阳性植株的获得及分子检测 23 2.2.6 农杆菌介导转化大豆及阳性植株的分子检测 24 3 结果与分析25 3.1 绿豆查尔酮异构酶基因的克隆25 3.1.1 绿豆 RNA 的提取与检测 25 3.1.2 绿豆 CHI 基因片段的获得 25 3.1.3 绿豆 CHI 基因片段的测序结果分析 26 3.1.4 绿豆 CHI 基因的拼接结果与验证 27 3.1.5 绿豆 CHI 基因的获得与生物信息学分析 27 3.2 绿豆查尔酮合成酶基因的克隆32 3.2.1 绿豆 CHS 基因的获得 32 3.2.2 绿豆 CHS 基因的验证 33 3.2.3 绿豆 CHS 基因的生物信息学分析 34 3.3 植物表达载体的构建及农杆菌转化40 3.3.1 植物表达载体 pFGC5941-CHI 的构建 40 3.3.2 重组载体农杆菌转化及验证41 3.4 叶盘法转化烟草42 3.4.1 重组载体的烟草遗传转化过程42 3.4.2 转基因烟草阳性植株分子检测43 转基因烟草 PCR 检测 43 转基因烟草阳性植株的 RT-PCR 检测 43 转基因烟草阳性植株的总黄酮含量检测 44 3.5 农杆菌介导法转化大豆45 3.5.1 种胚侵染转化