枯草芽孢杆菌lipA基因表达元件的修饰-生物化工专业毕业论文.docxVIP

摘要 在微生物的基因工程育种中，使用强启动子和稳定予表达目的基因，可以获啕 得高水平的表达效果。本文选择略商体 φ29 的 Al 启动子和枯草芽抱杆菌 aprE 基因的稳定子，构成一个新的表达盒，用于在枯草芽抱杆菌 OBI04 染色体上替 换 l伊A 基因原有的表达元件。本文主要对 lipA 基因表达元件原位修饰的基因操 作方法进行了研究。 采用重叠PCR方法，将两个IipA 基因间濒片段和红霉萦抗性基因片段拼接， 得到重组片段 LE; LE与质粒pEASY-Tl 载体连接，在大肠杆菌中构建了重组质 粒pTI-LE; 转化枯草芽抱杆菌 OBI04 ，筛选得到了具有红霉素抗性的l伊A基因缺 陷菌株OBI04Eo 构建了带有野生型 lipA基因片段的重组质粒 pTI-LA ，用于转化 OBI04E ，可以恢复l伊d基囚的缺陷:井发现 l伊 菌株可以在橄榄汹基本培养基 上生长，而l伊A商株则不能生长，橄榄油基本培养基能够用于筛选 lipA+的转化子。 通过重叠PCR方法，将Al 扇动子序列、 αrprE稳定子序列和上下游 l伊A基因同源序 列拼接，得到了重组片段 LPAS ，与质粒pEASY-Tl Simple连接，在大肠杆菌中构 建了囊组质粒pTI-PAs; 通过对质粒pTI-PAs 的测序，证明Al 启动子序列和aprE 稳定子序列按照预定设计拼接成一个表达愈;但质粒 pTl 平TA.s转化OBI0钮，在橄 榄油基本培养基上不能筛选出转化子，推测原因可能是表达愈没有功能，或者转 化方法存在问题。为了证明在 pTl 平TA.s转化过程中基因重组确实发生，采用酶切 连接的方法，将氯霉素抗性基因插入到 pTl 币TA.s中Al 启动子与上游同源片段之间 的EcoRI位点上:连接产物转化大肠杆菌，检测了将近 70 个商落，结果都是假阳 性菌，没有得到转化子的原因是重组质粒缺少筛选标记且连接体系不合适。另外， 因为特定序列限制了 PCR号|物的设计，将上下游同源序列、氯霉素抗性基因序列 如 和表达愈序列拼接为童组片段的童叠 PCR也没有成功。但是，根据本研究所获得 的经验，用这种方法在染色体原位修饰 l伊A基因的表达元件是可行的。 关键词: 1伊A 基因， 噬商体φ29 的 Al 启动子 ， aprE 稳定子， 重叠 PCR ， 枯草芽抱杆菌 OBI04 ，基因重组 ABSTRACT 4民 {It h In genentic engineering of microorganisms ，using promot町 and stabilizer will be able ωachieve a high level of gene expression. In this pape民 the A 1 promoter of phage φ29 and 伽 stabilizer of aprE gene of B.subtilis DB 104 were chosen ωform a new expression box， in order to replace all the expression element of /，伊IA_ gene of B.subtilis DB 104 in site. Recombinant fragment of LE，which is consisted of homologous segments of l伊. A gene and ermC fra阴阳t，wasωnstructed by over-lap PCR; and then the recombinant pl础mid of pTI-LE，with the method of sta臼 transformation to B.subtilis DB 104，an erythromycin resistance strain called DB 104E was constructed with its /伊IA_ gene delition. Recombinant plasmid of pTI-LA with wild type /伊IA_ segments was constructed，and then transformed to DB 104Eωrestored l.伊tA gene; it found th创 DBI04 growed well on olive minimal medium ，but DBI04E didnt grow 创 a11，which shows 伽at olive minimal medium can be used to screen