慢病毒介导的RNA干扰对人非小细胞肺癌化疗多药耐药性的分析-外科学专业毕业论文.docxVIP

慢病毒介导的 RN 慢病毒介导的 RNA 干扰对人非小细胞肺癌化疗多药耐药的研究 中文摘要 慢病毒介导的 RNA 干扰对人非小细胞肺癌化 疗多药耐药性的研究 中 文 提 要 目的 研究与肿瘤细胞多药耐药性（MDR）相关的两个基因 MDR1、MRP 对非小 细胞肺癌（NSCLC）的多药耐药性的关系。采用 RNA 干扰技术（RNAi），构建表达 Si-MDR1 和 Si-MRP 的重组慢病毒 PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP，转染人肺癌细胞 A549 及其耐顺铂细胞株 A549/DDP，研究化疗药物对 RANi 后细胞的杀伤效果，探讨 治疗 NSCLC 的新方法。研究共分三部分：第一部分 MDR1、MRP 基因 SiRNA 有效 位点的筛选；第二部分 Si-MDR1 、 Si-MRP 重组慢病毒载体的构建；第三部分 Si-MDR1，Si-MRP 逆转 A549/DDP 细胞耐药性的体外及体内研究。 方法（1）MDR1、MRP 基因各设计四个干扰位点，合成 SiRNA 片段, 分别连接 质粒载体 pSUPER 并转染人肺癌细胞 A549。48 小时后，荧光显微镜观察重组质粒对 A549 细胞的转染效率，荧光定量 PCR 检测 MDR1、MRP 在 mRNA 水平上的表达， 筛选出有效干扰位点用于慢病毒包装。（2）采用 PTM、pHelper1.0、pHelper0 慢病毒 载体系统介导 Si-MDR1、Si-MRP 的表达。转染 293T 细胞得到大量重组慢病毒，转 染 Hela 细胞进行病毒滴度测定。重组慢病毒转染宿主细胞 A549、A549/DDP 两天后， 流式细胞仪检测转染效率、荧光定量 PCR 和 Western Blot 检测 MDR1、MRP 在 mRNA 水平和蛋白水平上的干扰效率。（3）三种化疗药物顺铂（DDP）、阿霉素（ADM）、 健择（Gemzer）分别作用 A549-Si-MDR1 及 A549/DDP-Si-MDR1 细胞 24 小时后，荧 光显微镜观察 EGFP 阳性细胞形态变化。（4）PTM、PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP 在体外分别感染 A549 及 A549DDP 细胞（MOI=10）1 周后，加入不同浓度的化疗药 物：Gemzer、ADM、DDP，作用 48 小时后 CCK-8 试剂盒检测细胞凋亡情况。（5） 建立 PTM、PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MR 稳定转染的 A549 及 A549/DDP 细胞株，在 BALB/c 裸鼠体内建立原位肺癌异种移植模型，给予药物后观察动物体重、肿瘤生长 及多处转移情况，全面评价 MDR 表型。 结果（1）成功设计 MDR1、MRP 基因的 SiRNA 干扰片段，并构建 MDR1、MRP SiRNA 筛选质粒，pSUPER-Si-MDR1、pSUPER-Si-MRP 筛选有效干扰位点。（2）成 功将构建的筛选质粒转染到人肺癌细胞 A549 及其耐顺铂细胞株 A549/DDP 中，转染 48 小时后，荧光显微镜检测绿色荧光蛋白确定转染效率约 47.9%。（3）采用荧光定量 PCR 检测转染 48 小时后 A549 细胞中 MDR1、MRP 在 mRNA 水平上的表达情况。结 果显示， MDR1 、 MRP 基因得到特异高效的沉默，证明 pSUPER-Si-MDR1, pSUPER-Si-MRP 质粒构建成功，是有效的 SiRNA 表达质粒。（4）筛选出的有效干扰 位点序列用于慢病毒包装。转染 293T 细胞进行扩增，荧光显微镜及流式细胞仪检测 转染效率，结果证明包装好的慢病毒载体能高效转染 293T 细胞，转染效率 85%，并 能稳定表达 SiRNA。（5）重组慢病毒转染 Hela 细胞进行滴度测定，为 5×108TU/ml。 （6）PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP 均以 MOI=10 转染 A549 两天后，流式细胞仪检 测转染效率，PTM-Si-MDR1 转染效率为 77.3%，PTM-Si-MRP 转染效率 80.8%。（7） Real-time PCR、Western Blot 检测转染两天的 A549 细胞 MDR1、MRP 在 mRNA 水平 和蛋白水平上的表达，计算 MDR1 抑制效率为 72%，MRP 抑制效率为 69%，抑制效 果明显。（8）化疗药物 DDP（50ug/ml）、ADM（1ug/ml）、Gemzer（200ug/ml）作用 于 A549-Si-MDR1 细胞（转染一周）24 小时后，明场及荧光显微镜下观察细胞形态， 发现细胞皱缩，形态发生变化，出现凋亡现象。（9）不同浓度的 DDP、ADM、Gemzer 分别作用于 RNAi 后的细胞 A549 （ A549-PTM 、 A549-