酶解处理对虾致敏蛋白的致敏性影响分析-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

Allergenicity analysis of enzymolysis on shrimp allergenic protein By Chi Zhang A Dissertation Submitted to China Jiliang University In partial fulfillment of the requirement for the degree of Master of Science China Jiliang University June, 2015 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 中 国 计量学 院 或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 中国计量学院 有关保留、使用学位论文的 规定。特授权 中 国 计量 学 院 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借 阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论 文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 致 谢 在中国计量学院为期七年的求学生涯即将结束，将要开启人生的新阶段。 在此之际，首先要感谢我的导师潘家荣研究员，老师在科研方面学识渊博，底 蕴深厚，常常在三言两语之间点拨于我，使我受益良多。老师的写作内容，也 时常作为我学习的材料。在生活中，老师如父亲般的经验传授也让我在扬帆远 航之际走的更为扎实稳健。也要感谢食品系的黄光荣、戴贤君、关荣发、刘明 启、贾振宝老师对我实验的宝贵意见。 还要感谢梁世正、黄迅晨、冯涛，苏东阳，骆晓波，正是有了你们的帮助 才能使我完成实验，完成论文。也很开心能跟你们分享了三年快乐的时光，大 家一起打球喝酒的日子实令我难以忘怀。 接着要感谢师兄潘文彬，师姐诸葛洁婧对本文的帮助。还要感谢师妹杨维、 张洁、吴知盼、王爽、张文婷、付丽丽，因为有你们这些新鲜血液的加入才使 得天问 328 办公室其乐融融，在乏味的实验生活中增添了些许生气。 最后要特别感谢姣姣在我实验和论文出现瓶颈的时候给予我生活上的照顾 和工作上的关心与支持。 张弛 2015 年 03 月于杭州 酶解处理对虾致敏蛋白的致敏性影响分析 摘要：每年有大量人因为食用含有虾肉的食物导致过敏病症，这对人们身体健 康构成了严重威胁，对食物资源造成极大的浪费，因此对虾过敏原进行降敏研 究是非常必要的。随着对食物致敏原研究的深入，已有大量相关报道涌现，但 是此类报道大多采用体外酶联免疫吸附试验结果来表征抗原致敏性情况；而且 免疫原性的改变对其致敏性的影响也鲜有报道。为此本文以 PBS 提取虾蛋白、 盐析、等电点沉淀等方法分离得到虾主要致敏蛋白 Pen a 1，并制备虾致敏蛋白 多克隆抗体。以圆二色光谱和虾致敏蛋白多克隆抗体研究酶解处理对虾致敏蛋 白抗原性的影响，最后建立小鼠模型评价酶解处理对虾致敏蛋白致敏性的影响。 结论：酶解处理使小鼠体内 sIgE 水平下降了 40.44%、组胺含量下降 5%，但是 经过多次免疫，酶解后的致敏蛋白在小鼠体内依然能引起很强的变态反应症状。 本文以酶解虾致敏蛋白结构的改变与小鼠模型中致敏蛋白致敏性的影响为研究 内容，为探明致敏蛋白降敏机理做了铺垫。 根据已探明的虾致敏蛋白的相关性质，采用 PBS 提取、盐析等方法纯化， 成功制备了的 Pen a 1，并确定了优化后的制备条件为料液比 1：10 抽提，35% 饱和度硫酸铵盐析、等电点 pH4.5 沉淀、煮沸 15min 离心去除杂蛋白。经过质 谱和 Western Blotting 鉴定，确定该蛋白为虾致敏蛋白，且该方法提取后的 Pen a 1 活性良好。 将 Pen a 1 与弗氏佐剂混合，皮下多点免疫新西兰白兔制备虾致敏蛋白多克 隆抗体。得到的血清经过 Protein A 纯化后，经测定虾致敏蛋白多抗效价大于 80000，由抑制曲线得出 IC50 为 0.0448μg/mL。表明多抗效果良好。 采用碱性蛋白酶、风胃蛋白酶等 7 种酶水解虾致敏蛋白，SDS、OPA 法测定酶解结果，结果表明碱性蛋白酶效果最好。选用单因素实验和正交试验 的方法对碱性蛋白酶最适条件进行优化，获得最适条件为 pH9、温度 50℃、酶 解时间 3h、酶底物比 3000U/g。在该条件下测得酶解蛋白抑制率为 28.59%