罗氏沼虾雄性生殖系统特异性蛋白TAP的分子特征和生理功能研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docx

答辩日期: 答辩日期: 2010.06 .1 1 03阳例聊聊f 03 .U\l4:oJ 罗氏泪虾雄性生殖系统特异性蛋白 (TAP) 的 分子特征和生理功能研究 ‘ 论文作者签名 z 易主时 指导老师签名: .会加例乡/ 答辩委员会主席: 赵云龙 委员 1: 孙金生 委员 2: 方盛罔 委员 3: 章晓波 委员也 琛 委员 5: Date Date of oral defence: June，11，2010 Tbe m91??ular?haracteristic and vhys?olo2?caI function of T p in male reproductive tract of the prawn Macrobrachium rosenbe吨ii Authol气 signature: \Alpi 幡!认11 M臼 Supervisors signature: 〔μ 阳的/伊v Chair: Yun-Lo旦gZhao Committeeman 1: Jin.δ Committeeman 2: Sheng-Guo Fang Committeeman 3: Xiao-Bo 扭扭怠 Committeeman 4: ChenLuo Committeeman 5: Wei-Jun Yang 浙江大学博 -1:学位论文 罗氏沼虾雄性生殖系统特异性蛋白 (TAP) 的分子特征和生理功能研究 The molecular characteristic and physiological function of TAP in male reproductive tract of the prawn， Macrobrachium rosenbe咆ii 11 11 浙江大学博-i;学位论文 摘要 罗氏沼虾 (Macrobrachiun rosenbergii) 是一种重要的泼水经济虾炎，主要 分布在印度、太平洋热带及亚热带地区。其食性杂，生长快，生殖周期嫂，个 体大，具有很高经济价值。但目前对其生娟和受精的分子机制知之甚少。本文 以雄性罗氏沼虾为研究对象，开展关于精子成熟与生殖相关分子的研究，内容 如下: 首先， 采用全长均一化消减杂交 CFull-Length Nonnalization Subtractive Hybridization ，FNSH) 的方法，建立雄性生殖系统壶腹特异性基囚的消减文库。 通过差异性筛选并测序，获得 5 个壶腹特异性的序列。其中…个基因全长 768bp， 编码区 264bp，编码生成88 个氨基酸，推演的多肤含有 17 个氨基酸的信号肤 和 71 个氨基酸的成熟肤。 Genebank 序列比对分析，没有发现任何同源的核酸 和蛋白质序列，为一个全新的基因，命名为 TAP(Tenninmal Ampu11ae Peptide) ? 第二 ，TAP基因的表达特征检测。采用半定量 PCR 的方法，研究基因表达 的组织特异性，结果表明其主要在雄性生殖系统的壶腹中表达，且随着雄性个 体的生长发育其表达最增加。通过原位杂交的方法，研究基因的组织定位，发 现壶腹和精巢上都有表达，且在壶腹的内撵表皮分泌细胞和促雄性腺体细胞， 精巢的生精细胞中表达。 第三， TAP 蛋白的组织分布检测。采用 Westem blotting 的方法，研究蛋白 的组织分布，结果表明在雄性生殖系统的壶腹和精于中分布，且随着雄性个体 的成熟其表达量增加。通过免疫组化的方法，研究蛋白的组织定位，结果表明 在壶腹内攘的表皮分汹细胞和精子细胞中分布。通过免疫荧光和透射电镜免疫 组化的方法，进一步研究其在精子上的精细分布，结果表明其分布于精子基部 的突出部位和棘部。 第四 ，TAP基因的功能研究。采用刚 A 干扰的方法，研究其在精子成熟和 受精过程中的作用。利用半定量 PCR 和 Westem blotting 的方法，检测干扰效率， 浙江大学博七学位论文 结果显示核酸和蛋白表达水平下降 90%以上，干扰布效。 TAP基因沉默的雄性罗 氏沼虾在外观形态和行为上没有异常:雄性生殖系统中精巢的生精过程，输精 管中精子数量和壶腹中精英的形成，都没有变化。但是，壶腹中精子的活力发 生了巨大改变。利用明胶 SDS的方法，检测精子的蛋白水解活力，结果发 现干扰后精子的蛋白水解活力明显降低。问时，利用体外孵育精子提取物和卵 膜蛋白的方法，研究精子穿透卵膜能力，结果显示干扰后精子降解卵膜蛋白能 力下降。这些结果表明， TAP 蛋白参与调节壶腹中精子水解蛋白酶的活力。 进一步研究 TAP 蛋白在受精和受精卵发育过程中的可能作用