绵羊诱导多能性干细胞的制作与鉴定研究-临床兽医学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 The research on production and appraisal of Sheepinduced pluripotent stem cells A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Wang Cong-hui (Clinical Veterinary Medicine) Dissertation Supervisor:Prof. Zhang Yin-guo Researcher．Zhou Ping June,2015 本论文研究由以下项目资助： 兵团种质资源创新专项(2012BB042) 高产超细毛转基因羊新品种培育（2014ZX08008-001） 新疆生产建设兵团院士资金专项（2012BB024，2014BB023） 新疆农垦科学院引导计划（49YYD201209） This study was supported by the following projects: The Innovation special of Xinjiang production and Construction Corps(2012BB042) The breeding of High yield and super fine wool transgenic sheep varieties （2014ZX08008-001） The special funds of xinjiang production and construction corps (2012BB024，2014BB023) The science plan of Xinjiang academy of agricultural reclamation （49YYD201209） 摘要 2006 年， 山中申弥利用病毒载体将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）感 染小鼠体细胞，获得了类 胚胎干细胞的诱导多潜能性干细胞（iPS 细胞），为细胞学研究 提供了新的方向，也为再生医学领域带来了广阔的应用前景。动物 iPS 细胞的出现对疾 病模型的建立、细胞治疗，种质资源的保存、改善体细胞克隆动物的生产效率等方面都 有着重要的意义。 目的：在无饲养层条件下建立电穿孔转染五因子制备绵羊 iPS 细胞，掌握 iPS 细胞 诱导这一技术，为进一步研究细胞重编程机制及未来 iPS 细胞的临床应用奠定基础。 方法：1 本实验采用组织培养法，双酶法分离出中国美利奴成纤维细胞，并进行传 代培养。2 将含有人的 Oct4；Sox2、Klf4 ；l-Myc、lin28 基因的 3 个质粒，分别采用 4-D 电转染仪中 EH-100，EN-150，CZ-167，CA-137 四个电转程序转染到绵羊成纤维细 胞中，筛选出最适合绵羊成纤维细胞的电转染程序；细胞密度和质粒浓度均相同，质粒 浓度不同对 AP 染色阳性（AP+）克隆的影响；细胞密度，质粒浓度均一致，质粒比例 不同，对 AP+克隆的影响；细胞密度，质粒浓度，质粒浓度均一致，培养液中有无添加 Vc，对 AP+克隆的影响，以选出最适合制备 iPS 的方案。3 通过外形观察、定量 PCR、 免疫荧光染色、转录组分析等来检测所制备的绵羊类 iPS 细胞。 结果与结论：（1）双酶法快速成功分离出中国美利奴绵羊耳源成纤维细胞，为重编 程的提供优良的体细胞。（2）采用 EH-100 电转程序，细胞密度为 5×106 个/mL，质粒 比例 1:1:1，质粒质量浓度为 0.1 mg/L，培养液中添加 0.05 mg/L Vc 条件下，AP 染色阳 性（AP+）克隆形成率达 14%，优化的电转染的方法和培养方案有效提升了绵羊类诱导 性多潜能干细胞的制备效率。（3）在无饲养层条件下，通过电转染法将五因子导入绵羊 耳源成纤维细胞，并成功重编程为类 iPS 细胞，在外观形态、多能基因的表达、转录组 等方面的鉴定结果都表明其具有多潜能性，为以后进一步研究绵羊多潜能干细胞机制奠 定了基础。 关键词：诱导多能干细胞(iPS 细胞)，电穿孔转染，无饲养层，重编程 论文类型：A（基础研究） I Abstract In 2006, The recombinant plasmid containing Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc gene respectively was transfected into the fibroblasts cell of mice by vi