美洲蟑螂乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究-食品科学专业毕业论文.docxVIP

西华 西华大学硕士学位论文 美洲 美洲蟑螂乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究 I I PAGE PAGE VI 摘 要 本学位论文选用美洲蟑螂头部作为实验酶源材料，首先采用正交实验对美洲蟑螂头 部 AChE 的酶活测定条件进行了优化，其次采用盐酸普鲁卡因胺亲和层析法对蟑螂头部 AChE 粗酶进行了分离纯化，最后测定了其纯化酶对 16 种农药的敏感性，并与电鳗 AChE、粗酶进行了比较，为科学评估其是否可作为敏感酶源提供实验依据。主要研究 成果如下： 1、美洲蟑螂 AChE 的酶活测定条件的优化 美洲蟑螂 AChE 的基础酶活较高，且其酶活测定最佳反应体系条件为：底物浓度 1.0 mmol/L、酶冻干粉质量浓度 0.05 g/mL、温度 35 ℃、时间 10 min、pH 7.5，且这三种因 素对实验结果的影响程度从大到小是：pH 值、反应温度、反应时间。 2、美洲蟑螂头部 AChE 的分离纯化及特性研究 采用盐酸普鲁卡因胺亲和层析法对美洲蟑螂头部 AChE 粗酶进行了分离纯化，纯化 倍数为 172.04 倍，产率为 16.18%；纯化酶经过 SDS电泳，其相对分子量约为 78 kDa，与其它文献报道相近；蟑螂 AChE 的 Km 值为 0.0402 mmol/L，电鳗 AChE 的 Km 值为 0.0784 mmol/L，两者对底物 ATChI 的亲和力接近。 3、美洲蟑螂头部 AChE 对常用农药的敏感性研究 （1）两种 AChE 对五种有机磷农药（包括：敌百虫、敌敌畏、久效磷、速灭磷、 氧化乐果）的 IC50 无明显差异，其中对四种农药的敏感性基本保持在同一个数量级，只 有速灭磷有差异明显，蟑螂 AChE 对速灭磷敏感性要高于电鳗，IC50 值分别为 9.1×10-8 mol/L 和 2.28×10-7 mol/L；对蟑螂 AChE 和电鳗 AChE 两种纯酶而言，敏感性最强的速 灭磷与敏感性最弱的氧化乐果 IC50 之间分别相差 700、180 倍，范围跨度较大。 （2）两种 AChE 对七种氨基甲酸酯类农药（包括：速灭威、甲萘威、灭多威、涕 灭威、克百威、丙硫克百威、丁硫克百威）的敏感性无显著差异，IC50 值均保持在 10-6 M 数量级，但对异丙威的敏感性却相差一个数量级，蟑螂 AChE、电鳗 AChE 对异丙威的 IC50 值分别为 6.4×10-8、8.6×10-7 M；对蟑螂 AChE 和电鳗 AChE 两种纯酶而言，敏感性 最强与敏感性最弱 IC50 之间分别相差 41、33 倍。 （3）两种 AChE 对 16 种有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感程度较为一致；对氨基 甲酸酯类农药的敏感性要高于有机磷农药；对有机磷农药敏感性跨度范围要大于氨基甲 酸酯类农药。 （4）美洲蟑螂 AChE 纯化后敏感性略有提高，对敌敌畏、敌百虫、克百威的敏感 性分别提高 3、6、3 倍，而对甲萘威、速灭威的敏感性无改善。 （5）美洲蟑螂 AChE 对部分农药的敏感性要高于电鳗 AChE,可将其作为酶抑制法 替代酶源进行深入研究。 关键词：美洲蟑螂；乙酰胆碱酯酶；亲和层析；农药；敏感性 III III PAGE PAGE IV Abstract Periplaneta americana head was chosen as the experimental enzyme source material in this dessertation. Firstly, the AChE enzyme activity assay conditions of Periplaneta americana head was optimized with the form of ortogonal experiments. Secondly, procainamide hydrochloride pro and chromatography were adopted to isolate and purify the activity of acetyl cholinesterase (AChE) in the head of Periplaneta americana. Finally, the purified enzyme to the susceptibility of 16 kinds of pesticides was measured. Meanwhile, electric eel AChE and crude enzyme were compared to provide experimental basis for scientific assessment of whether it can be used as