蒙药童格勒格-1对大鼠肝细胞BRL株低密度脂蛋白受体基因表达的影响-生物化学专业毕业论文.docxVIP

内蒙古科 内蒙古科技大学包头医学院硕士学位论文 PAGE PAGE 4 前 言 目前脂质代谢异常的人群日趋增多，我国近3 亿人脂质异常。临床高胆固醇 血症患者中60岁以上占63.4%。血脂异常是造成冠心病、糖尿病及心、脑、肾、 肢体血管动脉硬化致血栓梗死等疾病的主要原因之一[1]。人血清低密度脂蛋白胆 固醇（LDL-C）的增高是引起动脉粥样硬化及心血管疾病的主要危险因子之一。 低密度脂蛋白受体（LDL-R）是一种膜受体，在人体中主要在肝细胞中表达较多， 通过受体介导的内吞作用来吸收和代谢血浆中的LDL-C ,在调节低密度脂蛋白代 谢和保持血液中胆固醇正常浓度方面起着非常重要的作用。低密度脂蛋白受体 （LDLR）功能缺陷可引起血液中LDL-C 的异常升高并导致冠心病等心血管疾病 的发生，同时也是引起高胆固醇血症和动脉粥样硬化（AS）的主要原因之一。家 族性高胆固醇血症( FH) 正是由于LDL R的基因突变引起的 ,是年轻人死于冠心 病、心肌梗塞的主要原因,FH在大多数人群中发病率为1/ 500 [2]。近几年来的研究 发现,不仅家族性高胆固醇血症(FH) 是由于LDLR 功能缺陷造成的,而且许多非 家族性高胆固醇血症也可发生LDLR 数量不足、程度不同的功能损伤,导致血浆中 LDL - C 水平升高,形成动脉粥样硬化。研究表明，他汀类（statins）药物在高脂 血症和动脉粥样硬化的治疗和预防中取得了显著的进展[3-4]。这些药物虽然能降低 动脉粥样硬化和心肌梗死的风险，但是也存在着肌肉骨骼方面的副作用[5-6]。更加 重要的是，有些病人对此类药物不敏感[7]。因此就需要有新的有着不同降脂作用 机制的药物来适应临床的需要。近年来，采用中草药防治高脂血症已成为当今研 究的重要方向，也取得了一定的成果。如黄连素、姜黄素这些从中草药中提取的 药物以及一些中药制剂都已证明有降血脂的作用[1,8]。蒙药童格勒格－1是一种单 味的蒙药制剂,在临床上表现出降脂、抗炎的作用。其主要成分为菊科蒿属植物的 叶、茎部分，在我国分布甚广，尤其是在内蒙古地区有较丰富的资源。通过动物 实验已证实童格勒格-1对高血脂模型大鼠的血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、 低密度脂蛋白—胆固醇（LDL-C）都有显著的降低作用，但其具体作用机理尚未 明确。而且也未见相关文献报道。本研究的目的就是想通过用蒙药童格勒格-1提 取物干预体外培养的大鼠肝细胞，从细胞的基因分子水平上观察蒙药童格勒格-1 对大鼠肝细胞BRL株LDLR表达的影响，以期探讨蒙药童格勒格-1调脂作用的可能 机制。 材料与方法 1 材料 1.1 主要仪器设备与试剂 1.1.1 主要仪器设备 （1）二氧化碳培养箱：美国 Froma； （2）酶标仪：ELX-800 美国； （3）低温离心机： 5804R 德国 Eppendorf； （4）PCR 仪：PTC-100 美国； （5）紫外分光光度计：U-2800 日本日立； （6）倒置相差显微镜：XDB-1B 国产； （7）凝胶成像系统：上海康乐； （8）电泳仪：DF-D 北京； （9） 紫外透射反射分析仪：KH-UVIII 上海康禾； （10）电子天平：FA1004 上海恒平科学仪器公司 （11）超净工作台：SW-CJ-2F 上海博迅； （12）恒温水浴箱，高速台式离心机，照相机等为国产； 1.1.2 主要试剂 （1）DMEM 培养基：美国 Gbico （2）MTT：美国 Amersco （3）DMSO（二甲基亚砜）：美国 Amersco （4）总 RNA 提取试剂、RT—PCR 试剂盒：购于大连宝生物公司 （6）胎牛血清：购于杭州四季青公司 （7）胰蛋白酶、台盼蓝：购于上海华美生物工程公司 （8）DEPC：美国 Amersco 1.1.3 试验细胞株：大鼠正常肝细胞 BRL 株购于中科院上海细胞所。 1.1.4 试验药物：试验用蒙药童格勒格-1 购于包头市蒙中医院，后由内蒙古医学 院药学院进行粗提物的制备。 2 方法 2.1 童格勒格-1 提取物的制备 童格勒格-1 提取物的制备采用回流法提取。药物分三次回流提取，每次 300g。 自然干燥童格勒格-1 用 95%乙醇回流三次，之后用 50%乙醇回流三次，每次 2h， 将回流液浓缩合并，之后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取得到乙 醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇的提取物。 2.2 大鼠肝细胞的体外传代培养 将购回的大鼠肝细胞培养瓶中的旧培养液弃掉，用 D-Hank’s 液洗两次，后 用 0.25%的胰蛋白酶进行消化，用量约为 2-3mL，消化时间约为 2-3 分钟。之 后用吸管吹打制成细胞悬液。将细胞悬液等量分装入两个 5mL 离心管中，之后 加入配好的完全培养基到 5mL 以终止