黄芪鲨烯合酶基因的克隆-细胞生物学专业毕业论文.docxVIP

摘 要 摘 要 荚膜黄芪为豆科黄芪属植物，中药上的黄芪指的是豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪 的干燥根，是我国著名的常用滋补中药。据药典记载，黄芪具有补气升阳、固表止汗、 脱毒生肌、利水脱肿等功效，主治气虚衰弱、消化力弱、自汗、盗汗、高血压、糖尿病、 水肿及疮疡久不收口等症。 黄芪中含有黄芪皂苷、多糖、黄酮、微量元素和氨基酸等多种有效成分，其中黄芪 皂苷是黄芪中主要的主要有效成分之一，具有降压、抗炎、镇痛和调节代谢等作用。国 内外对于黄芪的研究，近些年来主要集中在黄芪的化学成分的提取和鉴定，以及各种化 学成分的药理作用方面，而黄芪药用成分的生物合成方面的研究还尚未见报道。其应用 基础研究尚很薄弱，特别是其药用成分黄芪皂苷类化合物的生物合成途径的相关基因的 研究。因此对黄芪鲨烯合酶的基因克隆对黄芪和鲨烯合酶基因研究有一定的价值。鲨烯 合酶，又称为角鲨烯合酶，能够催化鲨烯的合成，不仅鲨烯自身的生物活性很强，被广 泛应用在医疗保健品和化妆品等方面，其下游甾体类和皂甙类产物具有重要的生理功 能，鲨烯合酶的活性影响类异戊二烯途径中的其他支路,也关系到其竞争的半萜类、二 萜类等物质，因此对于鲨烯合酶的研究越来越深入。 根据其他物种的鲨烯合酶蛋白中的高度保守序列，并参照其基因序列设计了一对保 守的中间引物和多对两端引物，通过多次 PCR 检测引物和中间引物扩增的效果，最后 确定合适的一对两端引物。最终从荚膜黄芪中克隆到了鲨烯合酶基因 cDNA 序列 （GenBank 登录号 HQ829974）。根据 DNAMEN 软件推测出黄芪鲨烯合酶蛋白序列， 通过与豆科植物其他物种的氨基酸序列比对发现黄芪鲨烯合酶推测的氨基酸序列与大 豆鲨烯合酶(BAA22559.1)和百脉根鲨烯合酶（AB102688.1）序列相似性最高，达到了 88%，且通过系统发生树可以看到黄芪与百脉根进化关系在比较的几个物种中最近。对 黄芪幼苗根叶茎中鲨烯合酶基因 mRNA 进行半定量 PCR，结果表明鲨烯合酶在黄芪根 叶茎中表达量是依次降低的。为了以后能够更方便的进行分离纯化黄芪中的鲨烯合酶蛋 白，本实验中针对鲨烯合酶基因疏水片段设计了引物，经 PCR 扩增后片段连接到表达 载体 pET-32a(+) Vectors 中，把重组质粒转化到 Rosetta 表达菌株中，经过 IPTG 进行诱 导，成功进行了蛋白表达。黄芪鲨烯合酶的克隆填补了黄芪中黄芪皂苷类化合物的生物 合成途径的相关基因研究的空白，为以后通过基因转化提高黄芪皂苷含量亦或通过生物 I 摘 要 工程手段生产黄芪皂苷打下了基础。 关键词 荚膜黄芪 鲨烯合酶 分子克隆 蛋白表达 II PAGE PAGE III Abstract Abstract Astragalus membranaceus (Fish.) Bunge is the Leguminosae Astragalus plants. Chinese medicine membranaceus is refers to the Astragalus membranaceus (Fish.)Bunge or Astragalus membranaceus (Fish.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao’ dry roots ,it is a famous popular tonic medicine. According to Pharmacopoeia records, Astragalus has qi Sun,solid form antiperspirant, virus-free tissue regeneration benefits of water off the swellingand other effects, indications Qi weakness, weak digestion, spontaneous sweating,night sweats, hypertension, diabetes, edema, and sore eventually becoming heal sickness . The medicinal part of Astragalus roots contains saponins, polysaccharides, flavonoids, trace elements and amino acids and other active ingredients, including astragalus Astragalus saponin is the main one of the main active ingredient, with blood pres