牦牛源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及重组外膜蛋白OmpH、OmpA免疫效果的初步分析-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的 研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表 示谢意。 研究生签名:、扬 时间: )?IJ 年 5月之0 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书 馆保存并允许被查阅。有杖自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名: ，:f各)  时间: 201) 年 5月 .}.P 日 导阶 时间:tO I?年)月2v日 I I 摘要 目的：巴氏杆菌病主要是由特定血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurellosismultocida, Pm)引起畜禽共患 的一种烈性传染病。如牛和水牛的出血性败血症，猪肺疫，兔脓血症，野生和家养鸟类的禽霍乱等。 Pm 给世界各地的畜牧业造成巨大的经济损失。由于其血清型较多，疫苗的免疫谱窄，保护期较短， 抗菌药物效果不稳定等原因，该病仍未得到有效的控制。本研究拟从临床发病牦牛中分离鉴定多杀 性巴氏杆菌，并对 omp H、omp A 基因序列进行生物信息学分析；原核表达、纯化 Omp H、Omp A 重组蛋白，免疫小鼠，观察比较两者对小鼠免疫效果。为有效控制牛巴氏杆菌病的流行和疫苗的研 制提供理论依据。 方法：1、从临床发病的牦牛无菌采取病料，分离纯化细菌。经生化及 PCR 鉴定，利用 PCR 方法鉴 定其荚膜血清型，并对其进行药物敏感性实验及小鼠半数致死量的测定。 2、参照 GenBank 中发布的 ompH、ompA 基因序列设计引物，扩增出 ompH、ompA 全长基因， 将其克隆测序，利用 DNAman、DNAStar 等软件进行序列分析。 3、根据扩增的 ompH、ompA 全长基因设计去信号肽的 ompH、ompA 基因，连接至 T 载体，常 规方法构建表达载体 pET-28a-ompH、pET-28a-ompA，转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞，IPTG 进行诱导表达，大量表达并利用 Ni 柱纯化重组蛋白。利用 Western-blot 方法检测其反应原性。 4、将纯化的重组蛋白制备成相应的单价苗和二价苗，将重组苗及全菌灭活苗分别皮下免疫小鼠， 以 PBS 为对照组。用 ELISA 检测方法评价小鼠抗体水平，三免后第 9 d 对小鼠攻 2×LD50 的分离株 多杀性巴氏杆菌，观察其保护性。 结果：1、分离得到牦牛源多杀性巴氏杆菌，药物敏感性实验表明其对庆大霉素、链霉素、四环素、 土霉素、磺胺等药物敏感。其荚膜血清型为B型，小鼠半数致死量为48.3 CFU/mL。 2、ompH、ompA基因的ORF分别为1 002 bp、1 077 bp，分别编码333、358个氨基酸，大小分别 为35.6743kDa、38.3432kDa。与GenBank上公布的代表株基因的相似性分别为82.3%-99.7%、 85.7%-99.7%，表明两者均具有很高的保守性。进化树分析表明两者分别与来自印度的血清型为B:2 的牛源P52株多杀性巴氏杆菌的基因亲缘关系近，同源性均达99.7%。 3、表达载体 pET-28a-ompH、pET-28a-ompA 能够在大肠杆菌中高效表达。融合蛋白分子量分别 约为 38.0 kDa、40.4 kDa，经 SDS检测两者均以包涵体的形式存在。Western blot 分析表明， 重组蛋白能与感染分离株多杀性巴氏杆菌的小鼠产生的血清产生单一的免疫印迹条带，具有良好的 反应原性。获得纯化的重组表达蛋白，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。 4、抗体检测发现全菌灭活组和 rOmpA 组抗体水平明显上升趋势，rOmpH 组和 rOmpH+rOmpA 组抗体水平升高但效价不高，而 PBS 对照组抗体水平则始终维持在较低水平。全菌灭活组小鼠保护 率为 80%，rOmpA 组小鼠保护率为 40%，其他三组保护率为 0%。但是，rOmpH、rOmpH+rOmpA 组可推迟小鼠死亡的时间，说明其有微弱的保护力。 结论：本研究表明牦牛源多杀性巴氏杆菌 ompH 和 ompA 基因具有很高的保守性，重组蛋白 OmpH 和 OmpA 能够刺激小鼠产生特异性抗体，重组 OmpA 蛋白产生的抗体对同型多杀性巴氏杆菌 2×LD50 的攻击具有保护力，但仍然不及全菌灭活苗，而重组 OmpH 蛋白产