绵羊Rad51基因的克隆与真核表达-临床兽医学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Clone and eukaryotic expression Rad51 gene in ovis aries A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Yang Jiao (Clinical Veterinary Medicine) Dissertation Supervisor: Prof. He Gao-ming Dr. Pi Wen-hui Dr. Zhou Ping June, 2015 本研究受国家转基因重大专项——优质转基因肉羊新 品种培育（项目编号：2014ZX08008-003）资助。 This research is supported by the National Transgenic Major Program named by The high quality of transgenic mutton sheep。(NO. 2014ZX08008-003). 摘 要 Rad51 基因可以介导同源重组修复，有助于维持基因组的稳定性，抵御细胞 毒性因子对 DNA 造成损害。本研究通过建立绵羊 Rad51 基因表达载体，并在绵 羊成纤维细胞中表达 Rad51 蛋白，对比致使同一基因 DNA 双链断裂的不同质粒 转染到绵羊成纤维细胞中 Rad51 基因的表达情况，探讨 Rad51 基因真核表达用 于克隆和提高同源重组效率，为提高绵羊成纤维细胞阳性单克隆数量奠定理论和 试验基础。 方法：试验一：选择 18 月龄萨福克母羊耳缘皮肤组织，采用Ⅳ胶原酶和胰 酶替代物（TrypLETM Select）两种混合酶消化法对耳缘成纤维细胞进行原代培养、 细胞传代、冻存、复苏，以期获得高纯度的绵羊成纤维细胞。试验二：设计绵羊 Rad51 基因 cDNA PCR 引物并进行反转录 PCR，产物插入到带有 AflⅡ和 XhoⅠ 酶切位点的 pcDNA3.1（+）构建真核表达载体 pcDNA3.1-Rad51，并用 PCR、酶 切、测序进行鉴定。试验三：选择 100μL 电转杯、 CZ-167 程序将 4μg Rad51 表 达载体、作用于 MSTN 的 CRISPR/Cas9 质粒和 TALENs 质粒分别导入到 2×106 个绵羊成纤维细胞，同时以 pMAX 空载体为对照检测质粒在细胞中表达情况。 试验四：采用实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）和蛋白免疫杂交 （Western Blot）对经电转染质粒的成纤维细胞 Rad51 基因在 mRNA 和蛋白水平 的表达进行检测，试验数据用 LSD 统计方法进行分析。 结果：试验一结果显示：通过两步酶消化法结合差速贴壁法可以获得高纯度 的绵羊成纤维细胞，该细胞贴壁后呈长梭形，生长状况良好（2 天可以长满 60mm 细胞培养皿）。试验二结果显示：设计的 PCR 引物从绵羊基因组扩增获得 Rad51 基因 cDNA 片段，将绵羊 Rad51 基因序列测序结果与 NCBI 公布序列比对，发 现从 ATG 起始密码子开始，第 90 位碱基发生替代：A-G（NCBI 是 G）。氨基酸 分析显示第 90 位碱基替代并未改变氨基酸，改变后的密码子与 NCBI 公布的密 码子为同义密码子，其余部分序列完全一致，成功构建绵羊 Rad51 真核表达载 体。试验三结果显示：成纤维细胞转染 pMAX 质粒 72h 发现大量绿色荧光蛋白， 且细胞在 6 孔板中的汇合度能达到 80%以上。试验四结果显示：DNA 双链断裂， Rad51 基因在 mRNA 水平表达量极显著高于正常细胞，蛋白质表达量于正常细 胞相比差异极显著；不同的 DNA 断裂方式，Rad51 基因的表达量亦不尽相同。 结论：以 pcDNA3.1（+）为骨架，插入扩增的绵羊 Rad51 基因 cDNA 成功 构建绵羊 Rad51 真核表达载体；经电转染 CRISPR/Cas9 、 TALENs 、 pcDNA3.1-Rad51、pMAX 质粒的成纤维细胞 Rad51 mRNA 和蛋白质表达极显著 高于与绵羊正常成纤维细胞量。 关键词：绵羊成纤维细胞；Rad51；同源重组；电转染 I I I Abstract Gene of Rad51 can lead the homologous recombination repair, help to maintain the stability of gene, resist cytotoxicity f