绿僵菌侵染相关基因Magas1的克隆和功能分析-生物学专业毕业论文.docx

Cloning and Functional Analysis of a Infection-related gene Magas1 in Metarhizium acridum A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Science By Xiangxian Zhu Supervised by Ass. Prof. Yueqing Cao Major: Biology College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China April, 2011 中文摘要 中文摘要 重庆大学硕士学位论文 重庆大学硕士学位论文 I I PAGE PAGE IV 摘 要 绿僵菌 (Metarhizium acridum)属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种致病力强的昆 虫病原真菌，具有对人、畜、农作物等无毒，无残毒、菌剂易生产及持效期长等 优点，具有广阔的应用前景。附着胞是昆虫病原真菌重要的侵染结构，在绿僵菌 成功侵染寄主一系列复杂的过程中，孢子萌发并分化形成附着胞是关键. 本实验室已构建了绿僵菌在附着胞形成阶段的均一化 cDNA 文库，本研究从 该文库中挑选了一个附着胞期间特异表达的基因 Magas1，克隆了该基因的全长 cDNA 序列(GenBank 登陆号：DQ496227)，生物信息学分析显示该基因编码 317 个氨基酸，含有 954bp ORF 框，同源性分析结果表明，Magas1 编码的蛋白质与 Aspergillus fumigatus 中的 mas1(XP747144)及 Magnaporthe grisea 中的 gas2(AF26- 4035)等均有很高的同源性。 半定量 RT-PCR 分析结果显示该基因在附着胞期间表达量最高，在孢子萌发初 期及菌丝时期亦有低水平的表达，在其它时期如体内菌丝时期、培养基上产孢时 期及虫体体表产孢时期几乎不表达。 以 Magas1 基因的启动子构建的 Magas1-EGFP 融合表达载体，通过激光共聚 焦显微镜检测发现到绿色荧光融合蛋白定位于附着胞的细胞质。 将该基因敲除后，与野生型相比，Magas1 基因突变株在 1/4SDAY 培养基上产 孢结构生成延迟，而两者在孢子萌发率及附着胞形成率上并无显著差异。毒力测 试结果表明突变菌株对东亚飞蝗的毒力比野生型显著下降，说明 Magas1 是绿僵菌 的一个毒力因子，而突变菌株膨胀压下降表明影响真菌穿透寄主体表。对该基因 的深入研究有助于了解昆虫病原真菌的形成及侵入机理。 关键词：绿僵菌，Magas1，附着胞，致病性 英文摘要 英文摘要 重庆大学硕士学位论文 重庆大学硕士学位论文 III III PAGE PAGE IV ABSTRACT Metarhizium acridum, belonging to Metarhizium spp , is an entomopathogenic fungi with virulence. It has the advantages of no residue, agents easy to produce and longer persistence, having broad application prospects. Appressorium is one of the most important structures in entomophthogenic fungus. The formation of appressoria are the key step during the successfully infection of M. acridum. The cDNA library of M. acridum germinating and differentiating on locust wing has been constructed in our laboratory. In this study, the Magas1 gene GenBank accession number: DQ496227) was selectd from this library for further analysis. The Magas1 gene has an open reading frame of 954 bp encoding a protein of 317 amino acid residues. Homolo