棉花GhMYB5基因的克隆及其启动子功能分析-生态学专业毕业论文.docxVIP

I I 摘要 MYB 基因是植物最重要的转录因子家族之一，广泛参与植物对非生物胁迫的应 答、植物形态建成、次生代谢调节等过程。本文根据本实验室测序分析的陆地棉 MaxxaBAC 文库，利用 RT-PCR 技术由海岛棉中克隆出一个新的 MYB 转录因子基因 GbMYB5（Genbank 登录号为：JF820389），以期为 MYB 基因子在植物抗非生物胁迫 方面的研究提供理论基础。研究进展如下： 1、RT-PCR 检测了 GbMYB5 在棉花不同器官组织中的表达情况。结果表明， GbMYB5 基因在植物的茎、叶、蕾、絮和种子中均有表达，尤以在叶子中的表达水平 最高。 2、RT-PCR 对 GbMYB5 基因在不同胁迫处理下的表达情况进行分析。胁迫实验 结果显示，重金属胁迫可短暂抑制 GbMYB5 基因表达，但表达量在处理 48h 后回升 至正常水平。PEG、ABA 和 GA 诱导均可增强 GbMYB5 基因的表达。 3、构建了植物表达载体 pCAMBIA2301-GbMYB5，其中含有 CaMV35s 启动子， 具有卡那霉素抗性筛选标记。经过 PCR 检测及双酶切鉴定，构建的载体符合预期设 计。 4、通过热激法将 pCAMBIA2301-GbMYB5 质粒载体转化农杆菌 LBA4404，PCR 检 测 结 果 表 明 含 有 目 的 基 因 的 质 粒 载 体 成 功 导 入 到 了 农 杆 菌 中 。 用 含 pCAMBIA2301-Gb 的根癌农杆菌侵染烟草，在筛选培养基上培养，PCR 鉴定 14 株为 阳性。 5、将抗性苗移栽至温室培养，提取烟草总 RNA，进行 RT-PCR 检测，结果表明 目的基因已在烟草转录水平表达，RT-PCR 鉴定 9 株在转录水平表达。 6、为明确 GbMYB5 基因的启动子功能，构建了含 GUS 报告基因植物表达载体 PBI101-T，并转化拟南芥。对拟南芥抗性株系进行 GUS 组织化学染色。结果表明， 在 GbMYB5 基因的启动子驱动下，GUS 报告基因主要在转基因拟南芥的根部，以及 幼苗期的叶片中表达。 关键词：棉花，转录因子，GbMYB5 基因，烟草转化，非生物胁迫，启动子，拟 南芥，GUS 组织化学染色 I II Abstract MYB transcription factor gene is one of the largest families in plants,which involved in responding to Abiotic Stress,regulation of secondary metabolism and the formation of plant organs.In this paper ,based on the previous research of our lab,a new MYB transcription factor gene GbMYB5（Genbank No.:JF820389）was isolated from Gossypium barbadense by RT-PCR,The main results of this study are as follows: 1 、 The expression pattern of GbMYB5 in different organs was studied using RT-PCR.The results showed that GbMYB5 was expressed in stems, leaves, buds, lints and seeds, whereas GbMYB5 gene was highly detected in leaves. 2、The expression of GbMYB5 under abiotic stress was detected by RT-PCR.The expression of GbMYB5 gene was inhibited in 24h after heavy metals stress and recover to normal level in 48h. Whereas the expression of GbMYB5 gene increased significantly under PEG, ABA of GA treatment. 3、A plant expression vector pCAMBIA2301-GbMYB5 was successfully constructed, which driven by CaMV