抗菌药物选择压力下的布鲁氏菌突变特征的研究-遗传学专业毕业论文.docxVIP

内蒙 内蒙古科技大学硕士学位论文 I I 摘 要 近年在我国部分地区布鲁氏病的发生率呈现逐年上升趋势，目前针对布鲁氏菌感 染患者普遍采用抗生素来治疗。由于一些用药策略的不合理现象导致布鲁氏菌对抗菌 素的耐药率越来越高。怎样降低布鲁氏菌对药物的耐药率，延长药物使用寿命，及时 治愈急性期病人，防止转为慢性病人，是亟待解决的重要课题。近年来在大量研究基 础上，有人提出了防耐药突变浓度 MPC（Mutant prevention concentration）假说与突变 选择窗 MSW（Mutation selection window）理论，为控制感染、降低耐药突变株的选择 性富集提供了新的思路。本研究测定利福霉素与头孢菌素等 4 种药物对布鲁氏菌 S2 株 的最低抑菌浓度 MIC（Minimal inhibitory concentration）和 MPC，并结合 PCR、DNA 测序等现代分子生物学方法检测耐药突变株的相关目的基因，从而阐明耐药菌株的突 变特征。这将为遏制布鲁氏菌耐药性的发生发展，优化抗菌药物的合理应用等提供有 利的数据依据。 试验中通过肉汤稀释法与琼脂稀释法分别测定了 4 种抗生素类药物(利福平、利福 布丁、头孢地尼、头孢吡肟)对布鲁氏菌 S2 株的 MIC 和 MPC。测定结果显示同类药物 中利福平和利福布丁对布鲁氏菌 S2 株的 MSW 范 围 分 别 为 4~460μg/mL 和 0.703~512μg/mL，SI 分别是 115 和 728。而头孢地尼对布鲁氏菌 S2 株的 MSW 范围为 0.2361~0.5764 ， SI 是 2.44 ； 头 孢 吡 肟 的 MIC 、 MBC 值 分别 为 0.0083μg/mL 、 0.2951μg/mL。通过对比 SI 值来看，头孢地尼利福平利福布丁。比较不同药物的菌 落恢复生长比率曲线可看出头孢地尼的平台区最短，而利福平和利福布丁的平台区比 较长；同类药物的比较中利福布丁的平台区要比利福平长，而头孢吡肟的实验中没有 观察到任何恢复生长的菌落，因此无法绘制出生长比率曲线。就此得出结论：三四代 头孢与利福霉素联合使用可以有效抑制布鲁氏菌的同时防止其耐药的出现。 研究中选取了不同药物浓度下生长的菌落并提取 DNA 后采用 PCR 扩增目的基因 片段进行测序。经序列比对分析后发现利福平与利福布丁筛选出的突变株中均存在 H536Y、S532L、H536R、R539H 氨基酸位点的突变。另外在利福平耐药株中还发现存 在 Q523L 突变体；利福布丁耐药株中还存在 521~523LSQ（1561~1569 位碱基）缺失、 Q523K、S541L 位点的突变，低浓度下还有极少数菌株被检出 rpoB 基因没有突变。最 后从 rpoB 的突变特征推测 H536Y 突变体可能是导致利福霉素耐药的稳定突变体。在 II II 头孢菌素耐药株的检测中发现 penA 基因突变的发生集中在第 385～560 位氨基酸序列 范围内。其中以 N477S、S484L、A559D 位点突变最为常见，其次还发现 F519I、 L387F、A559T、G485V、T499S 位点突变。随着浓度的增加最终突变体以 G485V、 T499S 位点突变为主；在 mrcA 基因 PCR 产物的测序结果中没有发现任何突变。这再 一次证实了细菌对头孢菌素敏感性降低或耐药是 penA 基因突变所导致的观点。 上述研究依次表明药物的结构与浓度可以影响细菌突变体的选择，在其选择压力 下一些稳定突变体的出现具有更重要的研究意义。 关键词：布鲁氏菌；抗生素；防突变浓度；突变选择窗；基因突变 PAGE PAGE IV Abstract Brucellosis is on the rise in many regions in China. Antibiotic therapy is the first choice to treat the Brucella-infected patients. Since improper use of antibiotics leads to resistance mutation, correctly choosing the antibiotics for the treatment of Brucella infection is very important. To assist doctors to dose the antibiotics, a theory of mutant prevention has been proposed stating that a dosage of an antibiotic above the minimal inhibito