哺乳动物RNA提取.pptx

脯乳动物RNA提取;; 总RNA 真核细胞的RNA主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt;方法;原理;RNase抑制;A;破碎组织;TRIZOL的组成;提取纯化;鉴定分析;1.电泳：溶液中带点颗粒在电场中朝着与其自身所带电荷相反的方向移动的现象。 利用各RNA分子（带负电荷）在电场中移动速率的差异对其进行鉴定。其速率与带电量成正比，与分子大小成反比。;提取方法;（一）准备工作;（二）试剂准备;（三??操作步骤;4.于2~8℃，12000r/min离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。 RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 5. 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。加入0.5ml(1ml TRIzol)异丙醇，室温静置10分钟。 6. 于2~8℃，12000r/min离心10分钟。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，去上清。 ; 7）加1ml 75%乙醇洗涤。 8）7500rpm，4?C 离心 1 min，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。;琼脂糖电泳检测;核酸浓度仪检测;电泳结果;A;D;读数A260，A280. 利用OD260=1时,RNA=40μg／ml计算RNA浓度 计算OD260／OD280 正常值应在1.8~2.0 小于1.75有蛋白质污染 大于2.0有DNA污染;应用（mRNA）;A;A;B;A;C;C;D;D;THANKS