黄瓜再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化-蔬菜学专业毕业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 黄瓜再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化 黄瓜再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 摘 要 黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国设施和露地主要栽培的蔬菜作物之一，生产中黄 瓜经常受到干旱、盐碱、病虫等因素的胁迫，严重影响了黄瓜的品质和产量。通过工程 手段改良黄瓜现有品种，把育种技术从宏观水平提高到微观水平，为品种改良提供了一 条全新途径。运用生物工程技术培育高产、高抗、多抗、优良的黄瓜新品种已经成为黄 瓜育种工作的发展方向，为今后持续培育新品种和大幅度的改良现有品种提供了科学的 手段和途径。高效的黄瓜再生和转化体系是黄瓜转基因育种的基础，因此，进一步研究 影响黄瓜再生和转化的各种因素，优化黄瓜再生和转化体系具有重要的理论和实践意 义。 本课题在前人研究基础上，从外植体类型、外源植物激素、外植体切割及接种方式、 外植体苗龄、内源激素变化等方面进一步研究影响黄瓜再生的各种因素，建立了完整的 黄瓜子叶节高效再生体系，并在此基础上通过 Kan 选择压试验建立了农杆菌介导的黄 瓜子叶节遗传转化体系，将黄瓜反义 cuPLDα 基因转入黄瓜体内。取得主要结果如下： 1．子叶节是黄瓜离体再生的最佳外植体，子叶节离体再生受外源植物激素、外植 体切割及接种方式、外植体苗龄苗态等因素的影响。MS 添加 1.5 mg/L BA 是诱导子叶 节产生不定芽的最佳培养基；切除子叶部分的 1/3，切除叶缘平铺是子叶节组织培养的 最佳切割和接种方式；6-7 d 苗龄、两片子叶张开呈竖直状态的无菌苗有较高的再生频 率且便于操作；MS 培养基是诱导不定芽生根的最佳培养基；从子叶节接种开始至再生 植株移栽入土为止整个再生过程约需 50 d。 2．子叶节离体培养培养 0 d 时，ABA 含量最高，IAA 和 GA 含量最低；愈伤组 织诱导期（3-9 d），ABA、IAA、GA 和 ZR 含量先升高后降低；愈伤组织分化期（9-15 d），IAA 和 GA 含量均先升高后降低，ZR 含量一直降低，而 ABA 含量则先降低后升 高。这表明内源激素对黄瓜子叶节再生过程中的生理状态有着极其重要的影响，随着黄 瓜子叶节再生阶段的变化，内源激素含量也呈现不同变化，其种类、含量及协调平衡是 愈伤组织形成和不定芽分化的关键。 3．以子叶节再生体系为基础，建立农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系，主要包括： 预培养、侵染及共培养、选择及分化培养、生根培养等步骤。Kan 选择压 150 mg/L 可 以抑制非转化植株不定芽的产生，浓度为 250 mg/L Cb 能够有效抑制农杆菌的生长。 对 250 个子叶节外植体的遗传转化试验得到 20 个抗性芽丛，PCR 鉴定结果显示有 12 个株系呈阳性，转化率为 4.8 %。RT-PCR 检测结果显示转反义 cuPLDα 基因植株的 RNA 表达量显著降低，这说明外源基因已经成功整合到黄瓜基因组中，并在 RNA 水 平上对 cuPLDα 基因的表达产生干扰。 关键词：黄瓜；子叶节；根癌农杆菌；基因转化；磷脂酶 Dα Abstract Cucumber (Cucumis sativus L.) is one of the most important vegetable crops cultured both in facilities and in the open. The production of cucumber is often subjected to stress factors such as drought, salinity, pests and other factors of stresses, which seriously influenced the quality and yield of cucumber. Gene engineering provide a novel and efficiency way which enhance the breeding technology from the macro level to microcosmic level can improve the crop quality. Using biological engineering technology to foster new cucumber cultivars in high yield, excellent resistant, good quality have become the development direction of cucumber breeding