淋巴细胞的分化成熟和受体的基因表达-生物化学与分子生物学.PPT

1、双向电泳 1）原理 Smithies和Poulik(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳相淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是O’Farrell等首先于1975年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS—PAGE)。 2）分辨力 在最好状态下，传统等电聚焦技术和SDS在20cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带，因此，理论上的二维电泳分辨能力可达到10 000个点。目前已有实验室在30cm x 40 cm的大胶上获得这一分离效果。考虑到大多数实验室并不具备运行这种大胶所需要的条件，普通情况下的凝胶(20 cm x 20 cm)分辨到3000个点已是相当不错。但利用特殊的样品制备方法如三步提取或亚细胞器提取，以及窄范围等电聚焦胶条，都可大大提高二维电泳的分辨能力。二维电泳分离后的蛋白质点经显色方法如考马斯亮蓝染色、银染、负性染色、荧光染色或放射性标记等染色处理后，通过图像扫