生物化学讲义.PPT

阳离子交换介质 阴离子交换介质 离子交换层析Ⅱ 蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的pH下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，它们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。 离子交换层析Ⅲ 在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶段洗脱和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可以改变pH，也可以两者同时改变。 离子交换结合洗脱原理 梯度混合器 K=VM / VR 层析聚焦 用特种多缓冲液（polybuffer）淋洗层析柱中的特种多缓冲交换剂（polybuffer exchanger），就会在柱中产生一个由上而下的pH梯度。随着pH梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗脱下来。 利用选择性吸附的纯化方法 1．羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。 2．疏水作用层析：疏水层析介质有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱(washing)后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，将目的蛋白洗脱(eluting)。 （亲和层析） 亲和层析原理 高效液相层析和快速蛋白质液相层析 分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自动的仪器操作，它们有更高的效率、更高的分辨率和更快的过柱速度。 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 蛋白质含量测定Ⅰ 1．双缩脲法 双缩脲试剂：称取1.5g CuSO4· 5H2O和6g酒石酸钾钠溶于500ml水中，在不断搅拌下，加入300ml 10% NaOH，稀释至1000ml。 3ml蛋白质溶液加2ml双缩脲试剂，540nm比色。 2．紫外吸收法 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收。 蛋白质含量测定Ⅱ 3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定。 Folin-酚试剂的配制比较复杂。 4．BCA法 蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。 蛋白质含量测定Ⅲ 5．染料结合法 蛋白质能结合考马斯亮兰G250，显蓝色，595nm比色。 染色液的配制：考马斯亮兰G250 100mg，加50ml 95%乙醇（或甲醇）和100ml 85%磷酸，加水至1000ml。 蛋白质含量测定Ⅳ 6．胶体金测定法 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，根据颗粒大小的不同呈现不同的颜色（从小到大，从桔红色到紫红色）。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中。蛋白质分子可结合在胶体金颗粒的外层，使胶体金的颜色转变成蓝色。 蛋白质纯度鉴定 各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基酸测定一种，溶解度曲线单转折点。 四、蛋白质分离纯化的一般原则 1．前处理：先尽量除去不必要组织和部分，破碎细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。 2．粗分级分离：沉淀法、超滤法。 3．纯化：运用各种方法除去杂质。 不同离心场下沉降的细胞组分 相对离心场(g) 时间(min) 沉降的组分 1,000 5 真核细胞 4,000 10 叶绿体、细胞碎片、细胞核 15,000 20 线粒体、细菌 30,000 30 溶酶体、细菌细胞碎片 100,000 3~10h 核糖体 五、蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同的纯化方法透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration） 透析 超滤 磁力搅拌器 搅拌子 透析液 装有蛋白溶液的透析袋 根据分子大小不同的纯化方法（密度梯度离心） 常用于生成密度梯度的介质是蔗糖、聚蔗糖（Ficoll），分离核酸时还常用CsCl作为介质。 柱层析装置图 层析介质 （固定相） 蛋