转基因大豆检测实验设计.docVIP

转基因大豆的检测实验设计 生物技术安全评估09 2012年5月 目录 3. TOC \o 1-5 \h \z \o Current Document \h 实验一k大豆样品的准备 4 \o Current Document \h 实验二大豆DNA的提取和纯化 4 \o Current Document \h 实验三 靶标基因的扩增 6 \o Current Document \h 实验四反应产品检测 10 \o Current Document \h 实验五结果分析 12 参考文献 12 丽吞 随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的 大规模应用，转基因生物(Genetically Modified Organism)及其 产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。抗草甘麟 (glyphosate)大豆(商品名，roundup ready soybean)是在传统 大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘麟基 因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之 一,每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草 甘麟大豆的快速检测方法具有重要意义。基于核酸的检测技术主要有 PCR方法和基于PCR原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR等 等。普通PCR方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定 性检测方法，早在2003年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。 这些标准涉及的转基因作物有大豆(SN/T 1195-2003)、玉米(SN/T 1196-2003) 棉花(SN/T 1199-2003) 油菜籽(SN/T 1197-2003) 烟 草(SN/T 1200 -2003)和马铃薯(SN/T 1198 -2003) o目前广泛应用 于进出口商品的转基因成分检测。随后在2004年又制定了转基因定 性检测的国标(GB/T 19495.4-2004),该国标中用的方法还是普通 PCRO因此，普通PCR方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研 究。本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化, 靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。采用 PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检 测CAMV-35S启动了进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘麟基因。 实验一大豆样品的准备 一样品来源：（原始样品最小质量为：11200克） 1、 阳性抗草廿麟转基因大豆标准物质（IRMM-410R, Fluka公司） 2、 进口转基因大豆样品 3、 非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。 二样品加工过程： 1、 构成原始样品（原始样品不得低于试验样品的4倍） 2、 样品的初步处理（去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品 的质量变化） 3、 破碎和研磨 4、 缩分 5、 实验室样品的制备（实验室样品的最小质量不能小丁原始样品最小质量 的 1/16） 6、 存查样品和式样的制备 实验二 大豆DNA的提取和纯化 （CTAB 法） 一实验目的 掌握用CTAB法提取真核细胞总DNA的原理、步骤和注意事项。 二实验原理 1 CTAB （hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基澳化钱），是一种阳离子 去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 （＞0. 7mol/L NaCl）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15°C时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须 预热，且离心时温度不要低于15°Co 2、CTAB提取缓冲液各成分的作用： （1） Tris-HCl （pH8. 0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 （2） EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性 （3） NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解,存在于液相中 （4） C 3 -疏基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醍，避免褐变，使酚容易去除基因 组DMA （5） 主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡 泡。 三实验仪器和实验试剂 仪器：水浴锅 离心机EP管 电泳仪 研钵 试剂：去离子水乙醇氯仿-异戊醇液氮 CTAB 缓冲液：CTAB 20g/L, Tris-HCI 0. 1 mol/L(pH8. 0), EDTA 0. 02 mol/L. TE 缓冲液：lo nunol/L Tris. , 1 mmol/I, EDTA, pH8. 0). 酶溶液:5