鲤疱疹病毒Ⅱ型灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究-水产动物医学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．1．1传统疫苗 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．1．1传统疫苗 。10 3．1．2新型疫苗 。11 3．2疫苗的免疫途径 ．12 3．2．1注射免疫 ．．12 3．2．2浸泡免疫 ．．13 3．2．3口服免疫 ．．13 3．3影响疫苗免疫效果的因素 ．14 3．3．1疫苗免疫原性 ．．14 3．3．2免疫剂量 ．．14 3．3．3免疫佐剂 ．．15 4研究目的及意义 1 5 第二章鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)细胞培养灭活疫苗有效免疫剂量研究 17 1材料与方法 17 1．1实验材料 ．1 7 1．1．1实验动物 。17 1．1．2病毒与细胞系 ．．1 8 1．1．3实验试剂 ．．1 8 1．1．4实验器皿 ．．1 8 1．1．5实验仪器与设备 ．．19 1．2实验方法 ．19 1．2．1细胞培养灭活疫苗的制备 ．．19 1．2．2疫苗的无菌检验与安全性检测 ．．19 1．2．3疫苗有效免疫剂量的测定 ．．20 1．2．4注射免疫与采血 ．．20 1。2．5中和抗体效价测定 ．．21 1．2．6攻毒试验 ．． 21 1．3数据分析 ．21 2结果与分析 21 2．1疫苗的无菌检验与安全性检验 ．21 2．2中和抗体检测 ．23 2．3相对免疫保护率 ．24 3讨论 2zI 第三章CyHV-2灭活疫苗注射免疫异育银鲫效果研究 26 1材料与方法 26 1．1实验材料 ．26 1．1．1试验鱼及饲养条件 ．．26 1．1．2病毒、细胞系及菌株 26 1．1．3试验试剂 ．．27 Ⅱ 万方数据 鲤疱疹病毒Ⅱ型灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究1．1．4试验器皿 鲤疱疹病毒Ⅱ型灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究 1．1．4试验器皿 ．．28 l。1．5试验仪器与设备 28 1．1．6引物设计 ．．28 1．2实验方法 ．29 1．2．1 CyHV-2细胞培养灭活疫苗的制备 29 1．2．2吞噬原的制备 29 1．2．3注射免疫 。29 1．2．4样品采集与处理 30 1．2．4．1血清采集与处理 ．．30 1．2．4．2组织采集与处理 。30 1．2．5免疫指标的检测 ．．30 1．2．5．1血液生理指标 30 1．2．5．2吞噬细胞的吞噬活性 ．．30 1．2．5．3血清酶活性测定 31 1．2．5．4中和抗体效价检测 3l 1．2．6 Real．time PCR检测样品中几．11和C3补体基因表达量 31 1．2．6．1总RNA提取和eDNA的合成 3 l 1．2．6．2 Real．time PCR分析 33 1．2．7攻毒试验 33 1．3数据分析 ．33 2结果与分析 33 2．1血细胞计数 ．33 2．2白细胞分类计数 ．34 2．3吞噬细胞吞噬活性 ．35 2．4血清酶活性 ．36 2．5中和抗体效价 ．37 2．6免疫相关基因的表达变化 ．38 2．7相对免疫保护率 ．39 3讨论 39 结论 。41 参考文献 42 附录 ．．52 致谢 。53 ⅡI 万方数据 鲤疱疹病毒Ⅱ型灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究摘要 鲤疱疹病毒Ⅱ型灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究 摘要 异育银鲫(Carassius gibelio)是我国重要的经济鱼类，在淡水养殖中占有非常重 要的地位。近年来，我国鲫鱼养殖业中暴发一种病毒性疾病——鲫造血器官坏死症， 其病原为鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)，给鲫鱼养殖业造成重 大经济损失，严重影响了鲫鱼养殖业的发展。疫苗免疫被认为是预防水产养殖动物 传染性疾病最为有效的方法。本研究对CyHv-2细胞培养灭活疫苗的制备方法、有 效免疫剂量、鲫鱼免疫后的外周血免疫指标、血清生化指标变化规律与保护效果进 行了研究，初步建立一种预防鲫造血器官坏死症的免疫方法。本论文的主要内容如 下： 1．采用p．丙内酯(13-propiolactone，BPL)灭活细胞培养的鲤疱疹病毒II型 (CyHV-2)制备灭活疫苗，分别以不同剂量的疫苗通过腹腔注射免疫健康异育银鲫。 在免疫后7、14、21、28d，从对照组和各免疫组中随机挑选三尾鲫鱼尾静脉采血， 取血清进行中和抗体滴度测定。免疫30d后攻毒试验，每尾鲫鱼经腹腔注射500 ul 的1．0×10 7TCID50ml’1的CyHV-2活病毒，持续观察14d，记录鱼体死亡情况，评价 不同剂量疫苗的免疫保护效果。结果显示，免疫剂量为1．0×10 7TCID50ml‘1的试验 组，在人工感染试验后，其相对免疫保护力可达71．4％。 2．鲤疱疹病毒II型灭活疫苗注射免疫健康鲫鱼，分别于免疫后不同时间点采集 鱼体外周血和组织样，计数外周血红细胞和白细胞数以及白细