利用DNA Shuffling技术改造抗虫Bt基因的研究-遗传学专业毕业论文.docxVIP

利用DNA 利用DNA shuffling技术改造抗虫基因Bt的研究 中文摘要 Bacillus thuringiensis是一类广泛存在于土壤、灰尘、植物、水和昆虫中，革兰 氏阳性，在生长的某个时期形成芽孢和伴孢晶体的杆菌。许多具有对鳞翅目、双翅 ．一●一一一+’～。 目、鞘翅目、膜翅目、直翅目特异杀虫活性的Cry蛋白被分离出来。尽管已经有许 多有效的突变方法已经用于研究Cry蛋白，但是依然有一定的局限性。本研究就是 使用DNA shuming技术来创造一个拥有各种不同突变和突变位点的巨大突变体库。 本试验以改造合成的5个历基因(crylAb、crylAc、crylC擎,cry2A和cryYC事) 为材料，利用DNA shuffling这一体外分子进化技术，构建了一个含有1000个重组 基因克隆的大肠杆菌表达库；通过诱导表达重组蛋白，以棉铃虫为试验昆虫进行蛋 白毒性实验。并对这1000个重组克隆进行了测序，通过对这些重组基因与原始5个 基因进行序列同源性比较。发现与crylAb，crylAc、crylC*、cry2A·和c,y9c幸具有 序列相似性的克隆分别为235个、186个、16个、420个和88个，未知序列55个。 1000个重组克隆中筛选到毒性增强的重组克隆主要是与cry2A基因同源。 crylAc来源重组克隆组中，表达蛋白杀虫数目高于对照CrylAc的克隆为5个， 持平的有2个，毒性降低的为179个，其中完全丧失毒性的克隆有116个。420个 来源于cry2A*的重组克隆毒力测定结果显示，杀虫效果明显提高的克隆有132个； 毒力持平的克隆有6个；毒力下降的克隆有282个。与crylAb有序列相似性的有235 个，在1000个重组克隆中数量居于第二位。其杀虫毒力略低于CryIAe，但是在杀 虫数最多的10个重组基因中，也只有1个克隆977来源于crylAb，这一点和crylAc 相同。来源于crylC*的重组杀虫蛋白数量最少，仅为16个。这可能是因为该蛋白 在基因同源性上与其他4个基因存在较大差异。来源于cry9C*的重组蛋白所占1000 个重组克隆的比例为8．8％。相较其他基因也较少。其中来源于cry9C*的重组蛋白绝 大部分为失去毒力或者降低毒力。 在毒性降低或丧失的克隆中，多数是产生了移码突变导致大量的氨基酸序列的 改变，部分则是由于末端序列的移码、提前出现终止密码等因素。而毒性与原始基 因相当的克隆则是由于所表达的氨基酸序列没有变异，或者氨基酸突变的位点位于 三维结构外侧，对与膜结合的能力和杀虫毒力均没有影响。 分析了crylAc和czy2A*-A芒．源的克隆中单氨基酸位点突变对蛋白结构和功能的 华中农业大学2000届硕士研究生学位论文影响，发现毒性提高的重组克隆突变位点分布在3个结构域中，但大部分都位于结 华中农业大学2000届硕士研究生学位论文 影响，发现毒性提高的重组克隆突变位点分布在3个结构域中，但大部分都位于结 构域1和2中。突变的位点多为单个氨基酸或相邻的少数几个氨基酸，它们分布在 整个蛋白的不同螺旋和折叠中。突变后的氨基酸如R127L、R127F能够提高结构域 1的疏水性从而有利于整个三级结构的稳定。还有克隆305、323中的突变如T296H 增加了结构域2的正电荷，有利于蛋白与带负电荷的膜受体结合。还观察到了一些 突变热点位点，如cryL4c来源克隆中第124、127、296位氨基酸，cry2A·来源克隆 中的第12．14、25．28、140．146位氨基酸。 DNA shuffling技术提供的这1000个突变体为我们研究重组后基因的突变位点、 突变类型对蛋白毒力的影响提供了材料，通过分析该突变氨基酸所在结构域位置和 理化性质对整个杀虫晶体蛋白的结构和功能的影响。同时也为转基因抗虫育种提供 了新编码的高毒性蛋白的基因。 关键词：苏云金芽胞杆菌；DNA shuffling crylAb；crylAm crylC*：cry2A·； cry9C·；结构；功能 2 利用DNA 利用DNA shuffling技术改造抗虫基因研的研究 AB STRACT Bacillus thuringiensis(BO is a gram-positive，spore-forming bacterium that exists worldwide in soil，dust,plants，water and insect cadavers．Cry proteins span a wide range of insect orders(Lepidoptera,Diptera,Coleoptera,Hymenoptera,and Orthoptera)．Many mutation techniques h