人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究.docxVIP

人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究 作者：王振显 蔡文清 庞国勋 宋永周 陈康宁 孙福振 杨涛  【摘要】 目的 探讨人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)进行膀胱替代修复的可能性。方法 用去污剂洗涤和酶消化方法制备HAAM。将大鼠MSCs在体外培养、扩增、传代。取第4代干细胞用1%二甲亚砜预诱导h，然后应用膀胱匀浆上清液诱导d。将诱导分化后的MSCs接种于HAAM表面进行短暂体外培养，获得组织工程膀胱。将雄性大鼠60只随机分为3组，行半膀胱切除术，然后分别采用负载干细胞后的HAAM、HAAM以及单纯缝合的方法进行修补，每组20只。分别于术后2、4、w测定膀胱容量、进行膀胱造影并取材观察组织再生情况。结果 去污剂洗涤联合酶消化法能有效去除人羊膜中的细胞成分，光镜及电镜观察无细胞成分残留，细胞相容性好。大鼠膀胱重建术后，A、B两组与C组膀胱最大容量(Volmax)比较有极显著性差异，而A、B两组之间膀胱最大容量比较无显著性差异。组织学观察，w时HAAM即已吸收降解，膀胱移行细胞和平滑肌细胞开始形成，A组吻合修补区较厚，平滑肌细胞规则且丰富。结论 HAAM作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速，负载MSCs后构建的组织工程膀胱是理想的替代修补材料。  【关键词】 膀胱；移植；脱细胞羊膜；生物医学工程  最早应用组织工程学原理进行组织工程膀胱构建的是Wake forest大学医学院再生医学研究所的Atala等人，他们于1998年进行了同种异体狗再造膀胱的实验研究〔1〕。目前组织工程学技术的研究主要集中在二个方面：①支架材料的研究与开发；②种子细胞的培养和植入受损的组织，使其功能得到恢复。膀胱无细胞基质和小肠黏膜下层是目前报道最多的组织工程膀胱支架材料。羊膜是一种天然高分子生物材料，来源广泛，不违背伦理。本研究采用化学去污剂和酶消化的方法去除新鲜羊膜中的细胞成分，保留细胞外基质，制备人脱细胞羊膜作为支架材料，并以大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞构建了组织工程膀胱，探讨异种来源的HAAM作为生物支架材料构建组织工程膀胱的可行性。  　1 材料与方法  实验材料  ～6周龄100～150 g健康清洁级SD大鼠2只，8周龄220～250 g大鼠4只，雌雄不限。8周龄以上成年健壮雄性300～500 g大鼠60只，由河北医科大学实验动物中心提供。LDMEM及%胰蛋白酶，胎牛血清、,PBS液，二甲基亚砜，1% TritonX100,小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白一抗，山羊抗小鼠二抗。日本Olympus荧光倒置显微镜IX71和光学显微镜CX31。SHZ88台式水浴恒温震荡器。  种子细胞培养  SD大鼠MSCs的分离与原代培养〔2〕  ～6周龄大鼠2只，无菌取其双侧股骨、胫骨和胸骨，用LDMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液，离心后用生长培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，37℃、5% CO2环境下常规培养。  大鼠膀胱匀浆上清液对MSCs的诱导分化 　　8周龄大鼠4只，无菌取其膀胱，立即用PBS液冲洗，匀浆、离心，取上清液用0.μm的针头滤器过滤。取第4代MSCs以2×104/ml密度接种于预置盖玻片的6孔培养板中培养d，使细胞贴壁。吸出培养基，换入含有1% DMSO的培养基预诱导h，然后换入膀胱匀浆上清液与DMEM为1∶1的混合培养基培养d。期间换液1次。 培养细胞免疫细胞化学染色鉴定及纯度 计算  诱导分化的MSCs以α平滑肌肌动蛋白抗体行免疫细胞染色，以未进行诱导的MSCs为阴性对照，进行同样的染色处理。光学显微镜下观察，随机选择10个镜野，计算纯度,纯度＝染色细胞数/细胞总数，取平均值。  HAAM制备  羊膜的选材  严格遵循供体医学标准。在获取健康胎盘后，PBS液反复冲洗，钝性分离羊膜与绒毛膜组织，去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织，浸泡于以 mol/L PBS液稀释的1% TritonX100中，反复震荡摇晃2h，然后置入1%胰蛋白酶中再震荡摇晃h取出，PBS冲洗。制备好的单层羊膜为白色半透明的薄膜，有一定弹性及韧性，厚约 mm。由于其较薄，缺乏一定的张力，尚不能用于手术修补。将6～8片处理好的单层羊膜按彼此纤维方向垂直的位置重叠，以200 W的可见光照射h，从而使其交联成～的较厚补片，张力大大增加，能耐受缝合牵拉的力量。以钴60射线照射20 min消毒后备用。  HAAM细胞毒性测定  按照 文献 〔3〕要求制备HAAM浸提液；取诱导分化的MSCs按1×104细胞/孔接