轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究-病原生物学专业毕业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 4．1外源抗原表位(P[81296，P[81381)的设计 4．1外源抗原表位(P[81296，P[81381)的设计 19 4．2引物互补片段的制备 20 4．3载体质粒pETP6F酶切片段的制备 ．20 4．4插入片段和载体质粒pETP6v酶切片段的连接及转化 ．20 4．5连接反应产物转化DH5a大肠杆菌细胞 21 4．6碱裂解法小量制备质粒DNA ．21 4．7酶切鉴定重组表达质粒 21 4．8大量制备质粒DNA 21 4．9核苷酸序列测定 21 5．重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白6F／P[81296，6F]P[81381在大肠杆菌 中的表达 21 6．重组载体蛋白(rVP6v)和重组嵌合蛋白的纯化 。22 7．Bradford法测定纯化蛋白的浓度 22 8．MAl04细胞复苏与传代培养 23 8．1 MAl04细胞的复苏 23 8．2 MAl04细胞的传代培养 23 9．RV增殖，收获 ．．23 10．RV的纯化 24 11．动物免疫及血清抗体的制各 24 11．1实验动物分组 。24 11．2免疫方案 一24 12．微量滴定法测Wa病毒感染性滴度 ．．25 13．重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白pETP6F298S／P[8]／296和 pETP6F298S／P[8]／381免疫豚鼠血清中和抗体效价的检测 25 14．Western blot检测纯化的重组嵌合蛋白的免疫原性 25 结果与分析 26 1质粒的构建 26 1．1 VP6基因的扩增 ．26 1．2携带RV VP6基因的重组表达质粒pETP6的构建及鉴定 ．27 1．3携带外源抗原表位的重组表达质粒p盯P6F298s／P【8】／296和 p盯P6F298s／P【8】／381的构建及鉴定 ．．27 2重组嵌合蛋白在BL21(DE3)中的表达和纯化 28 3纯化蛋白浓度的测定 29 4 RV病毒感染性滴度的测定和免疫动物血清中和抗体滴度测定 30 5 Western blot分析 ．31 讨论 33 小结 36 参考文献 37 万方数据 pI憬 pI憬 ． ． ． ． ． ． ． ．．41 (一)缩略词 。41 (二)主要溶液配方 。42 (三)主要实验步骤 ．50 (四)RVTB．CHEN株VP6编码基因核苷酸序列及氨基酸序列 。58 致谢 60 研究生简历 。61 独创性声明 ．63 学位论文版权使用授权书 。63 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文 轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白 同一位点表达比较研究 摘要 轮状病毒(RV)能够引起人类、哺乳动物类、禽类腹泻，其中A组RV是 引起婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体。完整的RV共有三层衣壳，其基因组包裹 在同心衣壳蛋白组成的二十面体颗粒中，由11个分节段的双链RNA组成。RV VP6蛋白位于病毒的中间层衣壳，既是病毒含量中最丰富的蛋白，也是RV的组 抗原蛋白。VP6蛋白氨基酸序列具有高度保守性，并具有较强的抗原交叉反应性； RV VP4和VP7是主要的中和抗体原蛋白。VP4蛋白在病毒外壳形成刺突样结构， 能独立诱导机体产生中和抗体。目前上市的RV疫苗均为减毒活疫苗，这些疫苗 虽有其优势，也有一定潜在的不足，开发安全有效的新型疫苗仍具有重要意义。 本研究选取VP4蛋白上具有高度保守性和抗原交叉反应性的第296—313位 和第381-401位氨基酸抗原表位进行重组抗原表位嵌合蛋白研究。采用基因工程 技术，成功构建A组人RV TB．Chen株VP6载体蛋白，将上述两个抗原表位分 别插入VP6蛋白载体基因同一位点，构建重组表达质粒，在大肠杆菌(E．coli) 细胞中成功表达出两个在VP6载体蛋白表面携带有VP4中和抗原表位的重组嵌 合蛋白。表达的嵌合蛋白可与相应抗体发生特异性反应：可诱导豚鼠产生特异性 血清抗体；抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F，Wa株病毒的VP6 和VP4蛋白，可中和Wa株病毒在MAl04细胞上的感染性。结果表明，所构建 和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免 疫原性；嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用。本研 究为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定较好基础。 关键词：轮状病毒；VP4抗原表位：VP6蛋白载体；重组嵌合蛋白；免疫原性 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文Comparative 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文 Comparative analysis of two rotavirus VP4 epitopes carried on