利用功能宏基因组技术对北极、大西洋海底沉积物中的新型蛋白酶、酯酶进行筛选、鉴定和性质研究分析-生物工程专业毕业论文.docxVIP

ffIlll ffIlll 1111IIIIIllllJ IIIIIIII IIIIJ Y25981 93 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 班J屋 日 期： 幽坚!么；羔 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者虢邀新签一啦坐丛 山东大学硕士学位论文目录 山东大学硕士学位论文 目录 }|ji：E i 中文摘要 I Abstract ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．III 符号说明及缩略词 ．vI 第一章研究背景和立题依据 ．1 1．1研究背景 1 1．1．1蛋白酶的概述 ．1 1．1．1．1金属蛋白酶 ．．1 1．1．1．2 Thermolysin家族金属蛋白酶 ．．2 1．1．1．3 Thermolysin家族金属蛋白酶的成熟机制 ．．2 1．1．1．4 Thermolysin家族金属蛋白酶的催化机制 ．．2 1．1．2酯类水解酶概述 ．3 1．1．2_1酯类水解酶的催化机制 一4 1．1．2．2酯酶／脂肪酶的分泌机制 5 1．1．2．3酯酶／脂肪酶的应用 6 1．1．3宏基因组学 ．6 1．1．3．1宏基因组学(Metagenome)的产生与定义 6 1．1．3．2宏基因组学的常用研究技术 ．．7 1．1．3．3宏基因组学的用途 ．．8 1．1．4功能宏基因组在研究在蛋白酶、酯酶／脂肪酶方面的研究进展 9 1．1．5采样位点信息介绍 10 1．1．5．1北极黄河站王湾生态环境 10 1．1．5．2大西洋TVG s／7位点信息 ．11 1．1．5．3海洋沉积物概述 12 1．2立题依据和研究内容 ．．12 1．2．1立题依据 12 1．2．2研究内容 14 第二章通过构建宏基因组文库筛选北极、大西洋海底沉积物中的蛋白酶、酯类水解酶基因 ．．]【!； 2．1引言 ．15 2．2实验材料 ．．15 2．2．1环境样品及实验菌株 15 2．2．2培养基 16 2．2．3主要试剂和试剂盒 16 2．2．4主要仪器设备 17 2．2．5数据库和分析软件 17 2．3实验方法 17 2．2．1环境样品的采集 17 2．3．2环境样品基因组DNA提取 ．18 2．3．3环境样品基因组DNA的纯化 ．18 山东大学硕士学位论文2．3．4宏基因组文库的构建 山东大学硕士学位论文 2．3．4宏基因组文库的构建 19 2．3．4．1末端补平 19 2．3．4．2连接反应 19 2．3．4．3受体细胞的制备 20 2．3．4．4包装、转染反应 20 2．3．5宏基因组文库的功能筛选和克隆子纯化 20 2．3．6亚克隆文库的构建以及活性筛选 21 2．3．6．1 EPl300电转感受态的制备： ．21 2．3．6．2亚克隆重组载体的制备 21 2．3．6．3电转反应 21 2．3．6．4活性筛选 22 2．3．7蛋白酶基因的获取和序列分析 22 2．4结果与分析 。22 2．4．1北极海底沉积物宏基因组文库的构建 22 2．4．2大西洋深海表层沉积物fosmid宏基因组文库的构建 ．．23 2．4．3 Fosmid宏基因组的活性筛选及克隆子纯化 24 2．4．3．1北极沉积物样品fosmid宏基因组文库的活性筛选以及阳性克隆的纯化 ：!zI 2．4．3．2大西洋深海沉积物样品fosmid宏基因组文库TVG5／7的活性筛选以及 阳性克隆的纯化 ．25 2．4．4通过构建亚克隆文库确定编码蛋白酶的基因序列 26 2．4．5编码蛋白酶基因的序列分析 27 2．5讨论 28 第三章蛋白酶的异源表达及其酶学性质研究 30 3．1引言 ．30 3．2实验材料 ．．30 3．2．1环境样品及实验菌株 30 3．2．2培养基 30 3．2．3主要试剂和试剂盒 30 3．2．4主要仪器设备 31 3．2．5数据库和分析软件 31 3．3实验方法 ．．32 3．3．1蛋白酶3c的基因克隆 ．32 3．3．2重组酶的异源表达 32 3．3．3