联合激光捕获显微切割与二维液相色谱串联质谱研究低恶性膀胱移行细胞癌蛋白表达谱和生物通路-外科学(泌尿外)专业毕业论文.docxVIP

联合激光捕获显微切割与二维液相色谱串联质谱研究低恶 联合激光捕获显微切割与二维液相色谱串联质谱研究低恶 性膀胱移行细胞癌蛋白表达谱和生物通路 研究生：牛海涛 导!Jili．孙光教授 中文摘要 目的： 膀胱癌是我国最常见的泌尿肿瘤。近年来研究发现，膀耽移行细胞癌从生物 学行为到病理形态可分成低恶性与高恶性膀胱移行细胞癌两种类型(g-被称之为 两类癌)。两类癌概念的提出为人们从分子与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分 类与研究提供了新的视角，并为阐明其发病机制与指导治疗，以及推测预后提供 了更具科学性的依据，具有重要的理论与现实意义。因此，本研究即是在其指引 下，寻找其差异表达蛋白，探究低恶性膀胱移行细胞癌的生物标记以及发病机制， 进而揭示其发病规律。同时，这也正是膀胱癌研究领域亟待解决的难题之一。 目前高通量研究蛋白质表达差异的主流技术是双向凝胶电泳 (two-dimensional gel eleetrophoreus，2-DE)，它根据蛋白质不同的特点分两相分 离蛋白质。第～相是等电聚焦(IEF)EIg泳，根据蛋白质等电点的不同进行分离。 第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)，根据蛋白质的分子量不同进行 分离。经过2DE以后，二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白，这样不同的 蛋白即可被分离，有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得 到。目前已经有几项膀胱肿瘤的的差异蛋白质组学研究，但鉴定的蛋白质数目很 有限，并不能体现出蛋白质组学技术中的高通量，而且2DE蛋白质组学技术存 在操作繁琐、不稳定和低丰度的蛋白不易检测等缺点，发展可替代或补充双向凝 胶电泳的新方法成为国际蛋白质组学技术研究最主要的目标。二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳(2D—CE)、液相色谱一毛细管电泳(LC．CE)等新型分 离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。这些蛋白质分离技术需要的样本含量 低，分离的效率高，而且不受分子量和等电点的限制。在充分考虑了2DE技术 的缺点并分析了蛋白质组学技术进展后，本实验决定中采用质谱鸟枪法(Shotgun) 即2D．LC．MS／MS质谱联用策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。另一个重要 即2D．LC．MS／MS质谱联用策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。另一个重要 的原因是在2DE蛋白质组学技术中需要样本含量大很难采用LCM技术，而 shotgun策略中由于蛋白质混合物分离方法的改进，对蛋白质上样量的需求减少， 从而使的LCM与2D．LC．Ms力订S的联合应用成为可能。 ．本研究在天津市应用基础研究重点项目(043114211)和国家自然基金项目 资助下，采用美国Thremo公司的ProteomoX．LTQ，结 合激光捕获显微切割鉴定了低恶性移行上皮癌以及相应正常尿路上皮的蛋白质 表达谱。在蛋白质鉴定的基础上构建了低恶性膀胱癌全蛋白质组表达开放数据 库，初步筛选出了与低恶性膀胱癌发病相关的候选差异表达蛋白质，并结合功能 聚类分析工具ArrayTrack和GenMAPP初步描绘了低恶性膀胱移行细胞癌相关的 生物通路。进一步的分析中通过与本课题组前期工作中鉴定的高恶性膀胱移行细 胞癌蛋白质表达谱相比对，寻找出了两类癌发生发展中肿瘤表型差异的分子基 础。 方法： 1．激光捕获显微切割获得正常膀胱移行上皮细胞以及肿瘤细胞：采用Pix Cell II LCM激光捕获显微切割设备获得正常移行上皮以及肿瘤细胞各250，000shots， 裂解后分别获得185．2Pg、147．6垤总蛋白，为进一步质谱分析奠定基础。 2．使用Finnigan线性离子阱串联质谱仪(LTQ)进行液相色谱一串联质谱鉴定 正常上皮以及肿瘤细胞的蛋白质表达谱，将实验结果与目前已经证实的膀胱癌及 肿瘤差异表达蛋白进行比较，同时选择2个差异表达蛋白质进行免疫蛋白印迹以 及免疫组织化学验证。 3．生物信息学工具分析鉴定的蛋白质：使用蛋白质分析工具鉴定蛋白质的基本 理化性质，包括总体平均亲水性，跨膜区预测，分子量以及等电点。并初步对比 正常上皮细胞蛋白质表达与肿瘤细胞表达蛋白的理化性质。 4．以本表达谱中鉴定的蛋白质为基础为蛋白质生物标记寻找进行循证生物医学 探索，以期得到生物标记蛋白基本理化性质的特点。 5．GO软件分析肿瘤蛋白质表达谱以及差异表达蛋白质谱。GO分析的同时计算 GO浓集／缺失表达，以了解肿瘤的细胞生理，并与尿液中蛋白质的GO分析比对， II 探索尿液中侯选生物标记蛋白的来源。 探索尿液中侯选生物标记蛋白的来源。 5．数据库构建：Dreamweave以及XMLeditor为主要软件构建开放蛋白质表达数 据库。数据库内容