利用SSH对犬小孢子菌在不同诱导底物表达差异基因的研究-皮肤病与性病学专业毕业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 裂趸蔫。 学位论文作者签名： 签字日期：—生年』月上Et 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 论文作者签名： 鏊歪茎． 指导教师签名：一凌鱼!亟垒垒 签字日期：当巴年上月应日 利用S 利用S SH对犬小孢子菌在不同诱导底物表达 差异基因的研究 硕士研究生： 张芙蓉 寺旨导教师： 杨国玲教授 指导小组： 杨国玲教授 张振颖医师 专业名称： 皮肤病与性病学 摘 要 目的：犬小孢子菌病是由亲动物性真菌．犬小孢子菌感染人类所致的 头皮、头发、光滑皮肤及甲的传染性皮肤病。随着生活水平不断提高人 们的生活习惯随之改变，猫狗等宠物与人类的密切接触导致犬小孢子菌 病的发病率逐年增加，特别是犬小孢子菌所致脓癣的病例数急剧增加。 有关该病的发病机制，近年多数学者明确提出蛋白酶在皮肤癣菌病中具 有一定致病作用，然而蛋白酶与脓癣的相关性及在脓癣中发病机制的研 究尚无报道。由于脓癣几乎发生于学龄前儿童头皮处，特殊的发病年龄 与部位，提醒了本研究的设想，即儿童头皮组织在犬小孢子菌所致脓癣 的发病中存在了某种特殊的致病因子，该因子是否就是文献所报道具有 致病作用的蛋白酶尚不清楚。因而，本研究设想以儿童头皮组织诱导底 物为tester，儿童光滑皮肤组织诱导底物为driverl，成人头皮组织为诱导 底物driver2，应用抑制消减杂交技术(SSH)分别比较犬小孢子菌在tester 与driverl，tester与driver2培养中表达的差异基因，再与genebank比对， 明确该些差异基因的功能，从而探讨犬小孢子菌在脓癣中的发病机制， 也为将来犬小孢子菌所致脓癣的防治及新药作用靶位的开发研究做出一 些探索。 方法： 1．将犬小孢子菌菌株接种于米饭培养基中，培养2周，分离出孢子。 2．将相同数量的孢子接种于含儿童光滑皮肤组织、儿童头皮组织和 成人头皮组织三种底物诱导培养基以及不含皮肤组织的阴性对照培养基 中，培养2 1．28天后收集三种底物诱导培养基中的菌丝团。 3．利用抑制消减杂交技术分别构建在含tester与driverl培养基中培 养的犬小孢子菌菌株正反向差异基因文库。 4．利用抑制消减杂交技术分别构建在含tester与driver2培养基中培 4．利用抑制消减杂交技术分别构建在含tester与driver2培养基中培 养的犬小孢子菌菌株正反向差异基因文库。 5．菌液PCR对所构建的4个文库进行初步筛选鉴定。 6．随机挑取上述构建的4个文库中鉴定为阳性的不等碱基数的各5 个克隆进行测序分析。 7．利用斑点杂交方法对tester和driver2正向消减文库初步筛选出的 部分阳性克隆进行第二轮筛选。 8．对筛选后的阳性克隆再测序，与NCBI上blast比对，进行初步分 析。 结果： 1．犬小孢子菌在含儿童光滑皮肤组织、儿童头皮组织和成人头皮组 织三种底物诱导培养基中生长良好，形成菌丝团块，阴性对照培养基犬 小孢子菌生长不良。 2．构建的tester与driverl的正反向差异基因文库及tester与driver2 的正反向差异基因文库中，以消减cDNA为模板的PCR产物大小均集中 在250．750bp大小片段。 3．四个库中各随机挑取240个阳性菌落，利用菌液PCR法对重组子进 行鉴定表现出单一扩增条带的克隆约占85％，片段大小多集中分布 250—750bp之间。 4．20个克隆，有4个克隆未测出，1 5个克隆在真菌中均为未知基因， 在tester与driverl正向差异基因文库筛选出1个克隆与genebank库中红 色毛癣菌线粒体细胞色素b和NADHl．5具有高度同源。 5．斑点杂交在tester与driver2正向差异基因文库中筛选出6个阳性基 因。GenBank中的BLASTN和BLASTX分析，6个差异EST在真菌中均为未 知基因，其中5个与其它物种的基因有较高的同源性(89％