蓝圆鲹肌肉金属蛋白酶的分离纯化及对胶原蛋白的作用-食品科学与工程专业论文.docxVIP

篓篓大学硕士学位论文 篓篓大学 硕士学位论文 蓝圆鳇肌肉金属蛋白酶的分离纯化及对胶原蛋白的作用 ldenti们Cation of a Meta¨oproteinaSe from Blue Scad(Decapterus maruadsl)M uscle and Its Effect on Collagen 指导教师： 曹敏杰教授 论文答辩日期： 2Q!§生Q鱼旦Q量垦 万方数据 学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人(签名)：徐栏 时间： ol奸6，目j5舌 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅不[}借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意等美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 麓一 万方数据 蓝圆鳇肌肉金属蛋白酶的分离纯化及对胶原蛋白的作用摘 蓝圆鳇肌肉金属蛋白酶的分离纯化及对胶原蛋白的作用 摘 要 金属蛋白酶(Metalloproteinase)是一类活性中心含有金属离子的蛋白酶。基质金属 蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是能够降解细胞外基质(Extracellular matrix． EcM)的最重要的金属离子依赖性蛋白酶。研究发现，MMPs参与鱼死后肌肉软化过程中 细胞外基质蛋白的降解。迄今为止，国内外海水鱼肌肉中基质金属蛋白酶的研究大多停 留在基因水平上，在蛋白水平上的研究报道较少。本文以海水鱼蓝圆鲣(Decapterus 疗聊。uadsi)为研究对象，对肌肉中降解胶原蛋白的酶进行研究，探讨金属蛋白酶对胶原蛋 白的作用。 利用明胶酶谱法，在蓝圆鲣肌肉中发现了一种能够分解胶原蛋白的金属蛋白酶。通 过硫酸铵盐析、DEAE—Sephacel阴离子交换层析、Phenyl．Sepharose疏水层析和Gelatin— Sepharose亲和层析，分离纯化了金属蛋白酶，其在SDS．PAGE电泳上显示为分子量分别 约为57 kDa和55 kDa的两个条带。性质分析表明，该金属蛋白酶在弱碱性条件下显示活 性，最适温度为40℃，最适pH为8．0，金属蛋白酶抑制剂(EDTA、EG‘FA、 1，10phenanthroline等)对其具有强烈的抑制作用。金属离子c2+、Ba2+和zn2+对其有激活 作用，其中Ca2+的激活作用最大。 同时，通过碱抽提、醋酸溶解以及氯化钠分步盐析等方法，从鲤鱼肌肉中分别纯化J／ I型和V型胶原蛋白。对V型胶原蛋白进行肽质量指纹图谱分析，从012链中得到8个有 效肽段共130个氢基酸残基，与斑马鱼V型胶原蛋白0【2链的序列完全一致，证明纯化的 蛋白为V型胶原蛋白。将其作为抗原免疫新西兰大白兔，成功制各其多克隆抗体，采用 免疫印迹法对抗V型胶原蛋白多克隆抗体进行特异性分析，发现其特异性较好。利用圆 二色谱分别对两种胶原蛋白进行热变性温度分析，I型胶原蛋白的热变性温度为28．5℃， V型胶原蛋白为30．5℃。以这两种胶原蛋白为底物，分析金属蛋白酶对这两种胶原蛋白的 降解能力。发现该酶在37。C和4℃均能有效地分解I型和V型胶原蛋白，推测其可能在鱼 体死后肌肉胶原蛋白的降解过程中发挥着重要作用。 本研究建立了一套比较有效的金属蛋白酶分离纯化方法，并对其在最适温度、最适pH、 抑制剂和金属离子对酶活性的影响等性质上进行了研究。此外，本研究还用纯化的酶对 胶原蛋白进行分析，结果表明该酶能够有效降解胶原蛋白，为揭示鱼体冷藏过程中肌肉 的软化机理提供了理论依据。 关键词蓝圆鳕：金属蛋白酶；分离纯化：明胶酶谱；降解；胶原蛋白 万方数据 Identification Identification of a Metalloproteinase from Blue Scad(Decapterus maruadsO Muscle and Its Effect on Collagen Abstract Metalloproteinases are enzymes that their active sltes are composed of metal ions and animo acid residues．Matrix meta王loproteinases(MMPs)are metal ion—dependent proteinases that are largely respon