细胞生物学实验技术（一).ppt

白色念珠菌（倒置显微镜下） 中间长梭型的是正在分裂的念珠菌 细菌和真菌的清除 使用抗生素 抗生素对杀灭细菌较有效。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。 95％以上是以下四种支原体： 口腔支原体（M.orale） 精氨酸支原体（M.arginini） 猪鼻支原体（M.hyorhinis） 牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii） 危害： 世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： 操作环境不良 操作人员的疏失 实验器具不洁等 已受污染的细胞 已受污染的培养基、血清 支原体污染 荧光染色法 电镜检查：扫描电镜、透射电镜 支原体培养 聚合酶链反应(PCR)法 支原体污染检测 细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 支原体污染表现 荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体 支原体的清除 支原体清除剂MRA （Mycoplasma?Removal?Agent）处理法 每4天换一次液，连续处理15天 清洗纯化法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 ? 药物辅助高温处理法 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。  共培养通常是一类细胞需要另一种细胞提供营养或者物理支持 小鼠胚胎干细胞 细胞运输 1. 保存在干冰或液氮中运输； 2. 培养在瓶中: 当细胞生长至50％汇合，瓶中 充满培液，瓶口封紧，运输途中培养瓶最好 呈直立状。细胞带至培养室后，在确保无污 染的情况下立即开封，用酒精消毒瓶口和瓶 身，吸出多余的培养液后将培养瓶平躺在培 养箱内。吸出的培液置于无菌容器中, 可用 于同一种细胞的培养。 血清的作用 1. 血清中含有许多营养物质如：蛋白、激素、生长因子、 细胞因子、维生素等； 2. 血清是很好的缓冲系统； 3．含有转运蛋白，如转铁蛋白、铜蓝蛋白等； 4．含有贴壁因子或粘附蛋白如纤粘连蛋白、胎球蛋白等可 以帮助细胞贴壁； 5．对于重金属有解毒的作用。? 血清的缺点 1. 血清成分复杂，不利于从培液中提取产物； 2. 有些物质能干扰实验结果，如受体和C3片段的检测；难以研究各种因子作用的机制; 3. 血清能促使成纤维细胞过量生长，故对上皮细胞培养不利; 4. 每批血清中成分不同，可以影响实验的结果，包括贴壁率等； 5. 易污染支原体。? 无血清培养的优点 1．便于研究激素、生长因子、细胞因子、维生素等对细胞生长和分泌功能的作用及其作用机理包括信号通路等。 2．作为选择性培养基，便于从原代培养细胞中选择目的细胞类型和较纯的上皮细胞。 3. 消除不同批号引起实验结果的不一致。 5．基因工程和细胞工程产物的后处理简单。 6．用于追踪肿瘤细胞的扩散。 7. 细胞工程临床治疗中降低免疫排斥。 使用无血清培养的注意事项 1．pH缓冲系统不如含血清者佳，培液中加 HEPES、细胞培养在CO2 培养箱中。 2．细胞经胰蛋白酶消化后需加入血清、BSA 或大豆胰蛋白酶抑制剂。 3． 细胞的冻存液中一般可添加血清。 使用无血清培养的注意事项 5．进行药物筛选实验时，用药量比含血清者 低十倍左右。 6．根据各种细胞不同要求添加贴壁因子和生 长因子，也可以将细胞先培养在含血清的 培养液中，待细胞贴壁后换成无血清培养 液；或将成系的细胞培养在不断降低血清 浓度的培养液中 (每传5次降低一次血清浓 度10％→5％→1％→0.1％)。 谢 谢！ 放映结束 感谢各位观看！ 让我们共同进步 * 细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对