利用DNA+Shuffling技术改造抗虫Bt基因的研究-遗传学专业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 舀 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：多k，)’行、 时间：zD p年IO月2了日 学位论文使用授权书 、须按照学 阳电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学／c ．论文的全 注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提； ．保密的论 学位论文作者铣知)、殍锄鲐专木圩蚂 签名日期：加f p年，驴月2了日 签名日期：加加年，D月zr日 因研的研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 因研的研究 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 ，，．，．、．^．卜 3 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5 7 1．1昆虫病理学和苏云金芽胞杆菌 7 1．2苏云金芽胞杆菌的发现 7 1．3苏云金芽胞杆菌的分类 8 1．4苏云金芽胞杆菌蛋白的分类 ．． 8 1．4．1 6一内毒素 ．9 1．4．1．1 6一内毒素的形态和结构 9 1．4．1．2蛋白质晶体的生化特性 ．9 1．4．1．3 6一内毒素的分类 9 1．4．2苏云金芽胞杆菌的其它毒素 10 1．4．2．1 B一夕}毒素(B-exotoxin) ．10 1．4．2．2 o一外毒素(a-exotoxin) ．10 1．4．2．3 Y一外毒素(Y-exotoxin) ．10 1．5苏云金芽胞杆菌蛋白质晶体毒素的致病机理 ．： lO 1．5．1杀虫晶体蛋白在昆虫中肠的降解 ．．10 1．5．2杀虫晶体蛋白与中肠细胞膜受体的结合 ．11 1．6苏云金芽胞杆菌蛋白质晶体的三级结构及其功能 ．1l 1．7苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的应用 13 1．7．1苏云金芽胞杆菌生物制剂的发展 ．．13 1．7．2转占t植物研究进展 ．14 1．8蛋白质分子改造的途径 ．．14 1．8．1随机诱变 ．15 1．．8．1．1物理诱变 ．15 1．8．1．2化学诱变 15 1．8．1．3致错PCR(ERROR-PRONE PCR) 16 1．8．2定向诱变 ．17 1．8．2．1寡核苷酸介导的定点诱变 ．．17 1．8．2．2引物定点引入法 17 1．8．2．3盒式诱变(cassette mutagenesis) 18 1．8．2．4重叠延伸PCR(overlap extension PCR，oE_PCR) ．．18 1．8．2．5大引物PCR法(megaprimer PCR) ．19 华中农业大学2000届硕士研究生学位论文1．8．2．6 华中农业大学2000届硕士研究生学位论文 1．8．2．6 DNA改组(DNA shuffling) ． 1．8．2．7 StEP重组 1．8．2．8核酸交换切割的DNA改组技术 1．8．2．9随机引物体外重组法 ．． ．1．8．2．10渐增切割法产生杂和酶 ．． 1．8．2．1l过渡模板随机嵌合生长 ．．24 1．8．2．12不依赖序列同源性的蛋白质重组 24 1．9研究的目的与意义 ．25 2材料和方法 ．26 2．1实验材料 ．．26 2．1．1基因来源 ．26 2．1．2菌株和载体 ．．26 2．1．2．1主要菌株 ．．26 2．1．2．2主要载体 ．．26 2．2实验方法 ．．26 2．2．1扩增5个Cry杀虫蛋白原始基因片段 ．26 2．2．2基因的片段化 27 2．2．3基因片段的重组 ．27 2．2．4重组片段与载体连接 27 2．2．5包含重组蛋白的阳性克隆筛选 ．27 2．2．6重组基因的序列测序 28 2．2．7重组基因的序列比对 28 ．2．2．8重组蛋白氨基酸性质分析软件 ．28 2．2．9重组基因在大肠杆菌中的诱导表达 29 2．2．10重组蛋白的杀虫毒力测定 ．29 2．2．11重组克隆Cry蛋白含量测定 ．．29 2．2．12重组蛋白杀虫数统计软件 ．30 3结果与分析 ．30 3．1 1000个重组基因克隆的获得 30 3．2 1000个重组克隆核苷酸序列的测定 ． ．．31 3．3 1000个重组克隆杀虫毒力的测定方法的确定 ．33 3．4