离子液体促进抗生素抗性基因水平转移及机理研究-环境科学专业论文.docx

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任 何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的 研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文 原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 汪 庆 2015 年 5 月 25 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请 和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明 为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘要 摘要 摘 要 环境中广泛存在的抗生素和抗生素抗性基因会导致很严重的人类健康风险。 环境中残留的抗生素所产生的选择性压力被认为是抗生素抗性基因出现、存在 和传播的最主要因素。但是，很多报道又发现在从来没有使用过抗生素的环境 介质中也检测到了抗性基因的存在。抗生素抗性基因主要通过接合、转化和转 导的方式在相同种属或者不同种属的细菌之间发生水平转移，从而导致抗性基 因在环境中的传播扩散。除了抗生素对抗性基因的筛选作用外，其他环境选择 性压力如重金属、消毒剂、洗涤剂、生物杀灭剂和纳米材料等都可以通过增强 水平转移来促进抗生素抗性基因在环境中的传播。 离子液体作为一种“环境友好型‖溶剂，已经广泛应用于能源，生物技术， 化学合成，化学工程，高分子材料，纳米技术等领域。现在还没有关于离子液 体直接在环境介质中检测的报道，但为了预防环境中离子液体的污染，现在很 多研究已经开始关注离子液体在环境中的毒理、降解、归趋和环境生态风险。 离子液体对细菌的毒理机制主要通过攻击细菌细胞膜的脂质结构使细胞膜受损， 引起细胞膜通透性改变甚至改变细胞膜的组成成分。而细胞膜是细菌同属或跨 属之间，细菌通过水平转移进行基因交换的重要阻碍。而细胞膜的通透性的增 加可以降低细胞膜对细胞与细胞之间相互接触甚至进行基因水平转移的阻碍。 到目前为止，离子液体是否可以促进细菌的水平转移从而增强抗生素抗性基因 的传播和扩散尚不清楚。 首先建立了微宇宙环境水样体系，考察离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷 酸盐([BMIm][PF6])作为一种环境选择性压力促进抗生素抗性基因在水环境中的 传播扩散。在微宇宙环境水样体系中，离子液体[BMIm][PF6]的暴露显著地促进 了 intI、sulI 和 sulII 基因含量的升高，并且含量都随离子液体[BMIm][PF6]浓度 (0.001-0.5 g/L)的增加而增加。但抗性基因 sulI 和 intI 含量的增加均不是总细菌 量的变化引起的。同时，磺胺类抗性基因 sulI 和 sulII 在水环境中的存在和传播 的机理存在差异。基因 sulI 与 intI 的绝对含量具有正相关性，但基因 sulII 与 intI 的绝对含量没有相关性。通过环境水样中筛选的土著菌 Alcaligenes sp（. 供体菌） 和 Acinetobacter sp.（受体菌）构建的 I 类整合子水平转移体系和 DNA 测序技术 I 证实了 sulI 在微宇宙环境水样中的传播扩散是由 I 类整合子介导的，而 sulII 的 传播扩散与 I 类整合子介导抗性基因传播无关。离子液体[BMIm][PF6]作为一种 选择性压力，通过促进 I 类整合子在环境土著菌之间的水平转移，导致抗性基因 sulI 和 intI 含量的增加。 进一步我们利用分子生物学技术，构建了含质粒 RP4 的 E. coli K12，并以 E. coli K12（RP4）为供体菌，选择天津水上公园的环境水样土著菌为受体，构建 了相对复杂的具有一定室外水环境条件的水平转移体系。结果发现质粒 RP4 介 导的水平转移频率随离子液体[BMIm][PF6]浓度(0.001-1.0 g/L)的增加而增加， 1.0 g/L [BMIm][PF6]暴露下的水平转移频率是对照组(0 g/L [BMIm][PF6]) 的 60 倍。同时，通过定量 PCR（q-PCR）技术，首次以多重耐药质粒 RP4 为指示标 志物，动态追踪抗性基因在离子液体 [BMIm][PF6]暴露的微宇宙环境水样水平 转移体系中的归趋。研究发现质粒 RP4 水平转移频率的增长趋势和 traF