狂犬病病毒CTN株G基因和N基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中文摘要狂犬病是由狂犬病病毒感染所致的急性致死性传染病，世界上除了少数儿个岛屿国家 中文摘要 狂犬病是由狂犬病病毒感染所致的急性致死性传染病，世界上除了少数儿个岛屿国家 外，绝大部分国家和地区具有狂犬病发生。我国是狂犬病的多发国，特别是近年来我国人 间狂犬病的发生呈上升趋势．据卫生部门的统计，2001年有862人死于狂犬病，2002年上 升到966例，病死率89．33％，高居甲、乙类传染病的首位。目前无有效的治疗方法，采用 疫苗接种是预防控制狂犬病的唯一有效途径。人用疫苗主要是灭活的组织培养疫苗，兽用 疫苗主要是减毒活疫苗。灭活疫苗需多次免疫，减毒活疫苗则存在发生回复突变而致毒力 返强的潜在危险。随着狂犬病病毒分子生物学研究的不断深入，特别是糖蛋白和核蛋白在 免疫学上的重要功能已经得到认识，国内外在研究狂犬病新型疫苗方面非常活跃，并取得 了可喜的成果。本文以人五型腺病毒为载体开展了狂犬病基因重组活疫苗的系列研究。主 要包括：(1)狂犬病病毒CTN株糖蛋白基因和核蛋白基因的克隆和序列分析；(2)狂犬病病 毒糖蛋白基因在COS7细胞中的瞬时表达；(3)应用pAdEasy系统构建表达狂犬病病毒糖蛋 白或核蛋白的复制缺陷型重组腺病毒；(4)表达狂犬病病毒G基因复制型重组腺病毒的构 建；(5)重组腺病毒动物免疫效果研究。得到结果如下： 1．我国固定毒株CTN株糖蛋白基因从起始密码子ATG到终止密码子TAA共有1575个核 苷酸残基，编码524个氨基酸残基。分析它的主要功能位点表明它具有319位的糖基化位 点和完整的抗原位点。比较它与我国疫苗株、国外疫苗株、我国的3株街毒株、CVS株和 Mokola病毒株的同源性关系，结果表明我国疫苗株和CVS株与我国的街毒株相距最远， 而CTN株与我国的3株街毒株相距最近，同属一个分支，推理得出CTN株适合于做我国 的疫苗株。 2．我国CTN株狂犬病病毒N基因由1353个核苷酸残基组成，编码450个氨基酸残基。 与我国疫苗株和国外一些固定株的同源性进行比较，结果核苷酸序列及其推导的氨基酸序 列同源性很高，平均分别高达91．2％和96．4％。具有狂犬病病毒共有的389位丝氨酸磷酸 化位点。抗原位点分析表明：所有毒株抗原位点I完全相同，抗原位点Iv上的序列变化较 大，主要发生在377位和379位，在抗原位点III除了中国疫苗株3aG和SaG以及日本兽用 疫苗株RC-HL有所变化外，其他都完全相同。 3．利用真核表达载体pcDNA3．1(十)在COS7细胞进行了G基因的瞬时表达，细胞免疫组 化方法检测到G蛋白能够正确表达，证明了克隆的G基因是正确的。 4．应用pAdEasy系统构建了表达狂犬病病毒G蛋白和N蛋白的复制缺陷型重组腺病毒 rAdEasy／GP和rAdEasy／NP。在电镜下能够观察到熬组病毒粒子．免疫组化方法和Westera rAdEasy／GP和rAdEasy／NP。在电镜下能够观察到熬组病毒粒子．免疫组化方法和Westera Blotting方法诞臻重缍痪毒感染293缨您鬈能正确表达塞G凝自毒鞋N骚叁：璧躯病毒驰遗 传稳定性很高，传代10代外源熬因仍不簧失。 5。嗣囊棱细胞内囿滔夔缀的方法蹶E3联转录方向把G基因插入到艨瘸毒载体中，捣建 了表达狂犬病痛毒糖蛋国的复制型重组腺病毒rAdG。Western Blotting方法{正明此重组病 毒能蟛正确表达G蛋白。 6．三种重组躲病毒免疫小鼠，翳生腺病毒免疫于#为阴性对照。用ELISA方法检测血清中 抗体的水平，结果rAdEasy／NP能诱导较离水平抗凝犬病病毒的抗体产生，在稀释度为1： 200对仍能检溯到抗体；rAdEasy／GP诱等小鬣产生抗体的能力较弱，稀释度达到I：100 就不能检测到抗体；rAdG和wAd免疫的m清未能棱测到抗体。 关键谰z狂犬瘸病毒，糖蛋白，核蛋白，熏组腺瘸礴，序列分析．真核表达 AbstractRabies，which Abstract Rabies，which caused by rabies virus，is an acute fatal zoonoptic infectious disease in most part of the world except a few island countries，Rabies continues to be a serious problem in China due to the reservior of rabies virus in domestic animals．Especially recent，incidence of human deaths annually ascends much．Based 0n Statistic result of healt