雷公藤内酯醇、高三尖杉酯碱对多发性骨髓瘤细胞的作用及其机理的研究-内科学(血液病)专业论文.docx

———————————————————塑!堂塑圭兰竺堡壅雷公藤内酯醇、高三尖杉酯碱对多发性 ———————————————————塑!堂塑圭兰竺堡壅 雷公藤内酯醇、高三尖杉酯碱对多发性 骨髓瘤细胞的作用及其机理的研究 浙江大学医学院 内科学(血液病) 02级博士生： 娄引军 导 师： 金 洁教授 摘要 多发性骨髓瘤(MM)是目前难以治愈的恶性血液病，虽经联合化疗、外周血造血千细胞 (PBSC)支持下的大剂量化疗等取得一定疗效，但最终都不可避免产生耐药。近年来，出现了 针对分子靶点的治疗，如反应婷、蛋白酶体抑制剂等，取得一定的成效，但仍迫切需要新的 药物。我们试图研究雷公藤内酯醇(TPL)和高三尖杉酯碱(HHT)对MM的作用及其机制，研 究分两部分： 第一部分：雷公藤内酯醇通过影响信号传导途径诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡 雷公藤内酯醇(TPL)是从传统中药卫矛科雷公藤属雷公藤中提取的活性成分，临床已经 ，。泛辟『于自身免疫性疾病：如类风湿性关节炎、肾炎、红斑狼疮等的治疗。近来研究发现雷 公藤还具有显著的抗肿瘤作用，但其对多发性骨髓瘤的作用，国内外尚未见报道。 采用MTT比色法检测，结果显示：经lOng／ml TPL处理48h，RPMl8226和U266细胞的 增殖明显受抑，与空白对照纽相比，差别有统计学意义(p0，05)。TPL作用RPMl8226和U266 细胞增殖48h的半数抑制浓度(ICso)均为25 ng／ml。进一步研究发现，外源性IL一6不能阻断 TPL对RPMl8226细胞的增殖抑制，TPL与常规治疗MM的药物地塞米松03EX)虽然无协同 作用，但与阿霉素(DOX)有协同或相加作用。更有意义的是，TPL也能抑制3例原代M／vl细胞 的增殖，48h的半数抑制浓度(IC50)为20-40ng／ml。TPL对正常单个核细胞的抑制作用相对较 弱，48h的半数抑制浓度(IC50)大于100ng／ml。为探讨TPL对MM细胞株抑制作用的机制， 我们从细胞凋亡及细胞信号传导途径两个层面作了进一步的研究。 浙江大学博士学位论文为了对细胞凋亡现象进行准确地定性或定量分析，我们采用多种经典、特异而敏感的实验 浙江大学博士学位论文 为了对细胞凋亡现象进行准确地定性或定量分析，我们采用多种经典、特异而敏感的实验 指标，并利用近年来发展起来的流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量、及磷脂酰丝氨酸 (PS)转位。结果显示，20—40ng／ml TPL作用48h，RPMl8226和U266细胞均可见典型的DNA 梯形条带：20ng／ml TPL作用24h，在流式细胞仪上可检测到E--倍体峰i进一步采用 AnnexinV．PI双标记法流式细胞仪分析，结果显示：RPMl8226细胞经10—40 ng／ml TPL作用 24h，凋亡细胞百分数分别为15．43％，28．29％，52．06％，明显高于空白对照组4．8％； U266 细胞10·40 ng／ml TPL作用24h，凋亡细胞百分数分别为t2．94％，15．93％，54．04％，也明显高于 空白对照组7．76％。 为进～步研究探讨TPL诱导细胞凋亡的可能途径，用Western—blot检测TPL对RP～118226 细胞caspase一8，一9，一3和PARP蛋白的活性变化。结果显示TPL(10—40ng／m1)作用细胞12h， 可见明显的caspase一8，一9，一3和PARP蛋白的激活带。 为研究TPL诱导MM细胞凋亡的可能机制及信号传导途径，本研究采用EMSA法分析 TPL作用前、后核转录因子NF—K B活性水平。结果显示TPL(10，20，40ng／m1)分别作用多 发性骨髓瘤细胞株RPM[8226、U266 6h后，NF—K B活性的抑制呈量效依赖性。对RPMl8226 细胞。抑制率分别为17．250／0，28，13％，48．13％；对U266细胞。抑制率分别为11．76％，49％，54．30。 由此实验结果推测，TPL对NF—K B活性的抑制可能是TPL诱导删细胞凋亡的原因之一。 不同浓度TPL(10-40ng／m1)处理RPMl8226 24h，用Western blot检测NF-K B的靶基因 bcl-xl也以浓度依赖的方式下调。 采用Western blot法，本研究测定了NF．x B的抑制蛋白1 K B o在TPL作用前、后表达 水平变化。结果显示，10．40ng／ml TPL作用12h，RPMl8226细胞I K B n蛋白水平表达量轻度 增加：相反D．I K B a(磷酸化I K Bo)蛋白水平表达显著下降。 我们进一步研究了细胞外信号调节激酶(ERK)在TPL作用前后的活性变化。Western blot 显示，TPL作用RPMl8226细胞12h后，随着TPL浓度(10-40