利用DGE技术筛选鸡×鹌鹑杂交种胚胎早期死亡相关基因-动物遗传育种与繁殖专业论文.docx

万方数据 万方数据 Using the DGE technology screening chicken×quail hybrid embryos early death related genes A Dissertation Submitted to Shihezi University In Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Agriculture By Li Qingfeng (Animal Genetic and Breeding) Dissertation Supervisor: Prof. Zhao Zong-sheng June, 2014 Shihezi, xinjiang, China 石河 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向 国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并 允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论 文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 本课题由国家自然科学基金（项目编号 ——《雌激素受体在鸡与鹌鹑属间杂交胚胎时期死亡 中的作用机理研究》资助完成 摘 要 鸡与鹌鹑之间的杂交属于非常典型的属间远缘杂交，其杂交后代早期胚胎出 现雌性大量死亡，且主要集中在孵化的第 3-5 天，该时间段刚好与其性别分化的 时间相吻合，已有研究表明性别分化相关基因与其死亡存在一定相关性，与性别 分化的调控机制比较复杂，参与的基因也很繁多，通过建立数字表达谱，筛选该 时期特异表达的与性别分化相关的基因，为更好的研究鸡与鹌鹑杂交后代在胚胎 发育早期雌性胚胎死亡和性别分化的机理奠定基础。 因此，本研究以鸡、鹌鹑及其杂交后代发育早期的胚胎为试验材料，通过形 态学观察和分子生物学方法对其进行准确的性别鉴定后，采用 Illumina 测序技术 对孵化到第 3 天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序，分别构建了雌性和雄性 个体发育第 3 天的 6 个 DGE 文库，筛选它们之间的差异表达基因，分析其在表 达趋势与测序结果是否一致，并对与性别分化相关的基因进行分析，旨在对比其 同鸡与鹌鹑杂交后代早期胚胎死亡之间存在的关系，具体研究内容及结果如下： （1）采集鸡、鹌鹑及其杂交种孵化第 3-4.5 天（每隔 12h 采样）的胚胎，通 过体式显微镜观察发育各时期的形态。结果表明，杂交胚胎发育各时期的形态变 化介于其父本鸡与母本鹌鹑的中间，各时期的形态发育与已有研究相一致，且鸡、 鹌鹑及其杂交胚胎发育第 3 天的形态特征基本一致。与此同时，以未知性别鸡与 鹌鹑杂交胚胎为研究对象，采取成年鹌鹑血液 DNA 为对照，用特异性引物 2550F/2718R 扩增出的鹌鹑 W 染色体上染色体螺旋蛋白基因（CHD）保守区作 为对照进行性别鉴定，结果表明 CHD 基因法对孵化早期胚胎进行性别鉴定的准 确率为 100%，可以应用于家禽早期胚胎的性别鉴定，同时保证了本研究采样的 准确性。 （2）以形态学和 DNA 水平扩增 CHD 基因进行准确性别鉴定为基础，通过 Illumina 测序平台对孵化第 3 天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序，分别构 建了雌性和雄性个体发育第 3 天的 6 个 DGE 文库，筛选它们之间的差异表达基 因，并对 GO 分析和 KEGG 通路等进行统计。结果显示，雌雄鸡、雌雄鹌鹑、 雌雄杂交禽胚胎比对到参考基因组的序列分别有 2840108、2817776、1343632、 1279590、1844727 和 1824082 条；雌雄鸡、雌雄鹌鹑、雌雄杂交禽、雌鸡与雌 杂交禽、雌鹌鹑与雌杂交禽的差异表达基因分别有 66、1340、72、130 和 605 个，与性别分化相关的差异表达基因分别有 4、2、3、9 和 8 个，以雌雄杂交禽 为实验组，其它四组为对照组筛选与雌性杂交禽胚胎早期死亡相关的差异基因， 包含有 HINTW、HINT1、cFOXL2 的等基因。随机选择 6 个差异表达基因进行 实时荧光定量 PCR（Real-time PCR），其表达趋势与测序结果一致，证明测序结 果的