免疫沉淀类实验-实验一水质的微生物检测资料文档.pptVIP

免疫沉淀类实验 南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心 教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生 实验课时：6学时 课程类型：专业实验课 课程要求：必修 每组人数：2人 实验目的与要求 掌握单向琼脂扩散试验、双向琼脂扩散试验、对流免疫电泳的原理、结果分析及应用； 熟悉火箭免疫电泳、免疫电泳的原理及应用。 实验内容 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验 对流免疫电泳 示教： 火箭免疫电泳 免疫电泳 一、单向琼脂扩散试验 一、单向琼脂扩散试验 实验原理： 将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，可从用不同浓度标准抗原制成的标准曲线上，查出待检样品中抗原的含量。 一、单向琼脂扩散试验 试剂与器材 商品IgG、IgM、IgA单向琼脂扩散板； 37℃恒温箱、湿盒、可调微量加样器等； 待检血清。 方法 分别取商品IgG、IgM、IgA单向琼脂扩散板1块，按说明书操作。 用微量加样器分别准确吸取不同稀释度待测血清10mL加于孔内。 将琼脂板放入湿盒中，置于37℃恒温箱扩散24小时。 一、单向琼脂扩散试验 注意事项： 加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备。 二、双向琼脂扩散试验 实验原理： 在含有电解质的琼脂中，抗原抗体分子互相弥漫扩散，当比例合适时可出现肉眼可见的白色沉淀线。沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度相关。 二、双向琼脂扩散试验 试剂与器材 含15g/L生理盐水的琼脂糖 待检血清、抗人血清 载玻片、湿盒、吸管、打孔器、37℃恒温箱、可调微量加样器等 方法 制板：用5～10mL吸管吸取溶化的含15g/L生理盐水的琼脂糖，于一洁净的载 玻片； 打孔：待琼脂板凝固后，用直径3mm的打孔器打孔，每孔之间的距离约4～ 5mm，根据需要，可打成呈梅花状、三角状的孔； 加样：用可调微量加样器根据需要在不同孔内加入待检血清和抗人血清10mL； 扩散：将琼脂糖凝胶板放湿盒中，置37℃温箱中24h后，取出观察结果。 二、双向琼脂扩散试验 注意事项： 加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察； 制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡； 打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。 三、对流免疫电泳 实验原理： 在一定的离子强度、pH8.4以上的缓冲液中，大多数抗原解离带负电，在电场中向阳极移动，而抗体大部分是IgG，其等电点与环境中的pH接近，很少解离。另外，由于分子量大，加上电渗作用缓慢向阴极移动，在短时间内，在两孔之间或抗体另一侧形成沉淀线。 试剂与器材 1.5%巴比妥缓冲液琼脂糖 待检血清、抗人血清 0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液 载玻片、吸管、打孔器、可调微量加样器、电泳仪、电泳槽等 方法 制板：用5～10mL吸管吸取溶化的含15g/L生理盐水的琼脂糖，于一洁净 的载玻片； 打孔：待琼脂板凝固后，用直径3mm的打孔器打孔，每孔之间的距离约 4～5mm，根据需要，可打成呈梅花状、三角状的孔； 加样：在孔中相向加入10mL抗原和抗体 ； 电泳：将抗原置于阴极侧，抗体置于阴极侧， 以4V/cm电压电泳30min～1h。 结果观察： 关闭电源，打开电泳槽，观察沉淀线的位置、数目与形状等。 注意事项： 加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察； 制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡； 孔距约0.5cm左右，太远看不到实验现象。 示 教 火箭免疫电泳 将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，冷凝后，在琼脂板的一端打一排小孔，分别加入一定量的待测样品进行电泳。抗原在电泳过程中，与抗体相遇，在比例合适时可形成锥形沉淀峰，其形状如火箭，故名火箭电泳。火箭峰的高度与抗原含量成正比，以峰高为纵坐标，已知的抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线图，就可知待检样品中抗原的含量。 示 教 免疫电泳： 免疫电泳技术是利用蛋白质分子量以及其所带电荷的不同，在电场作用下，蛋白质各组分迁移速度有别的性质，将蛋白质各组分分离，然后与槽中之抗体进行双向扩散，相应的抗原、抗体形成一条沉淀弧，从而形成一系列沉淀弧。根据沉淀弧的形状和位置，可对蛋白质的不同组分进行分析研究。 * * 结果观察 分别量取各孔样品沉淀环的直径，从相应说明书提供的参考标准曲线，计算待检血清中各种免疫球蛋白的含量。 二、双