生物技术制药第七章 酶工程制药.pptVIP

（3）转化反应 取2公斤核酸，缓慢加至预热至60-70度的360升、pH5.00.001摩尔每升氯化锌溶液中，用摩尔每升氢氧化钠溶液调至pH5.0-5.5，滤除沉淀，将清液升温至70度，加入上述湿的固定化磷酸二脂酶40公斤，，于67度维持pH5.0-5.5，搅拌反应1-2小时，根据增色效应，用紫外吸收法判断转化平衡点，转化完成后，滤出转化液，用于分离5’—单核苷酸，固定化酶再继续用于下一批转化反 （4）5’—复合单核苷酸的分离纯化 将上述转化液用6摩尔每升的盐酸调酸度至3，滤除沉淀，，滤液用6摩尔每升氢氧化钠调酸度至7，进入已处理好的氯-型阴离子交换树脂柱，流速为2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去离子水洗涤柱床，然后用3%氯化钠溶液以1-1.2升每分流速洗脱，当流出液pH达到7时开始部分收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制 （5）精制及灌封 上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器浓缩后，测定核苷酸含量，再用无热源水稀释至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%药用活性炭，煮沸10分，脱色和除热源，滤除活性炭，滤液经除6号菌漏斗或0.45微米孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为5’—复合单核苷酸 四、固定化酶法生产L-氨基酸 1.概述 氨基酸可用于医药、食品以及农业。合适比例的混合液可直接注入体内补充营养，氨基酸作为增味剂，可增加香味促进食欲，还可作为饲料制造人造纤维、塑料等 L-氨基酸可化学合成，但化学合成得到的是混旋体，还需拆分，拆分方法有物理化学法、酶法等，其中酶法最为有效，产生的产物纯度较高 2.工艺路线 （1）固定化氨基酰化酶的制备 将预先用pH7.0、0.1摩尔每升磷酸缓冲液处理的DEAE-葡聚糖-A-25溶液1000升，在35度下与1100-1700升的天然氨基酰化酶水溶液一起搅拌10小时，过滤后，得DEAE-葡聚糖-酶复合物，再用水洗涤，所得固定化酶的活性可达16.7万-20.0万单位每升，活性得率为50-60% （2）L-氨基酸的制备 上述制得的氨基酰化酶装柱，将化学合成的混旋氨基酸上柱，根据拆分的对象不同，选用不同的流速，通常进料流向采用自上而下为宜。将酶柱流出液蒸发浓缩，然后调节pH，使L-氨基酸在等电点条件下沉淀析出，通过离心分离后，可收集得到L-氨基酸粗品和母液。粗品在水中进行重结晶，可进一步纯化。而在母液中可加入适量乙酐，加热盗0度，其中的乙酰-D-氨基酸就会发生为消旋反应，产生乙酰-DL-氨基酸混合液，在酸性条件下（pH1.8），析出的外消旋混合物可重新作为底物进入酶柱水解 用固定化法连续生产L-氨基酸，产物的纯化比较简单，收率也比游离酶法要高，因此生产单位量L-氨基酸所用的底物量少。固定化酶很稳定，用于酶的费用大大减少，生产工艺可自动控制，改善了劳动强度，大大减少了用于劳动力方面的费用，因此经济意义很大 第六节 酶工程研究进展 一、酶的化学修饰 1.目的和意义（1）天然酶的缺陷：易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米氏常数过高；酶作为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用（2）酶的化学修饰：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术（3）目的：提高酶的稳定性、降低或消除酶分子的免疫原性（医药） （4）意义:扩大了酶制剂的应用范围，同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段 2.常用化学修饰剂 （1）要求：较大相对分子量；良好的生物相容性和水溶性；分子表面有较多 的反应活性基团；修饰后酶的半衰期较长 （2）常用修饰剂 ①糖及糖的衍生物：右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳 ②高分子多聚物：聚乙二醇，聚乙烯醇 ③生物大分子：肝素，血浆蛋白质，聚氨基酸 ④双功能试剂：戊二醛，二胺 ⑤其他，固定化酶载体，糖基化试剂，甲基化试剂，乙基化试剂和小分子有 机化合物 * * * * * * 第七章 酶工程制药 第一节 概 述 一、酶的特性 酶是生物催化剂，大多数酶的本质是蛋白质，有些酶是核酸。酶作为生物催化剂的，除具有一般催化剂的特性：加快反应速度、降低反应活化能、不改变反应平衡点、反应前后无数量和性质变化等外，还具有独自的特点：催化效率高、专一性强、反应条件温和、催化活性易受调节和控制。酶由国际酶学委员会分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类 二、酶工程简介 1.定