基因工程的操作过程.ppt

每个平板大约20ml的培养基 平板培养基 重组DNA的转化 1、实验目的：（p81） CaCl2制备感受态细胞，用于重组质粒的转化。 2、实验原理： 亲缘关系、菌体的年龄、环境因子（ CaCl2 、cAMP） 感受态细胞的制备 接种DH10B于LB培养基中37℃振荡培养过夜。 接100μl培养液于5ml的LB液体培养基中，37℃条件下振荡培养2-2.5小时左右，OD600达0.4。 将1.5ml培养液移至eppendorf管中、冰浴20min。 4℃条件下，4000rpm离心5min，弃去上清液。 添加0.75 ml预冷的CaCl2溶液，用枪轻轻吹打。 冰浴30分钟后，4℃条件下，4000rpm离心5min，弃去上清液。 细胞沉淀用100 μl预冷的CaCl2溶液悬浮。 冰浴放置，备用。 转化 取一管100μl的感受态细胞，加入质粒与目的基因的连接产物5μl，轻轻用枪吹打均匀，冰浴20 min 42℃、保温90秒钟，迅速放入冰中，冰浴5 min。 添加1 ml的LB培养基。 37℃振荡培养1小时。 3000 rpm 离心5 分钟 ，弃去1ml上清，余下0.1ml用枪吹匀，吸至含有抗生素的LB培养基平板上，另添加20μl 20mg/ml X-gal和40μl的100 mmol/L IPTG，均匀涂布。 37℃倒置培养8-12小时。 转化细胞的扩增