细胞培养理论cell culture biology.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * Cell cycle 不同细胞在细胞周期各阶段中的持续时间 细胞 来源 间期(h) M期（h) 细胞周期(h) G1期 S期 G2期 正常淋巴细胞 人 3.7 12 1.8 0.5 18 T细胞 人 10.5 7.6 3.2 0.8 21.1 正常结肠细胞 人 15-20 10-20 1-8 1 24-48 正常直肠细胞 人 3.3 10 4 1 48 W1-38胚肺细胞 人 8 8 4 0.8 20.8 急性淋巴细胞性白血病细胞（骨髓） 人 1-10d 16-24 2-3 1 2-10d 急性粒细胞性白血病细胞（骨髓） 人 20-60 16-20 3 0.47-0.60 40-83 皮肤癌细胞 人 9-62 11-21 5-6 25-97 G2+M期共5-6 宫颈癌细胞 人 1.1-1.5 9.3-11.8 2.6-3.6 14.3-15.5 G2+M期共2.6-3.6 Hela细胞 人 10.5 10 4.0 0.5 24.5 结肠癌细胞 人 15-20 10-20 15 1 22-125 CHO 中国仓鼠 4.7 4.1 2.8 0.8 12.4 艾氏腹水癌细胞 小鼠 4.7 8.5 3.8 1 19 细胞死亡 细胞死亡有三种形式： ①衰老死亡； ②病理死亡； ③程序性死亡/凋亡（apoptpsis）。 正常培养细胞凋亡不如衰老明显，永生化细胞和肿瘤细胞凋亡功能丧失。培养细胞是研究凋亡很好的对象。 1. 培养细胞的遗传学 1) Chromatin and chromasomes 培养细胞的遗传学特征 2) Sex of cell Barr or Y 小体 Primary cultural cell Cell line 肿瘤细胞 培养条件良好的情况下,二倍体核型可长期保持，否则发生偏离二倍体现象 细胞遗传学检测技术及应用 核型分析：计数、分带技术 溴脱氧尿苷掺入技术（5-bromodeoxy uridine, BrdU） M0细胞：浓染 M1细胞：淡染 是胸苷的类似物，能替代胸苷掺入DNA，使掺入后所形成的染色体着色性减弱，而且着色的变化程度与BrdU的掺入量相平衡 染色体脆性部位检查 染色体预凝集试验 姐妹染色单体交换（sister chromatic exchange, SCE） 脆性部位是指具有染色体断裂倾向的特定部位。一般出现在部分分裂的细胞中，通常累及2个染色单体，表现为染色体型的畸变。 当一个间期细胞和一个分裂期细胞融合时或融合后，其中一个细胞核第一次进入分裂期时，处于间期细胞的染色体能提前凝集成染色体的现象。 细胞培养成功率分析 组织和供体年龄 培养条件 贴附底物 培养方法 影响细胞生长的因素 不同细胞生物性状类型 正常二倍体细胞 永生化细胞 肿瘤细胞 遗传缺陷细胞： 来自遗传病患者细胞 人工转化细胞 杂交细胞 克隆化细胞株 细胞附着底物 ?玻璃 ?一次性塑料 聚苯乙烯： 聚四氟乙烯： 充电荷;亲水性 非充电荷 可剪成小块植入培养瓶内，细胞贴壁。 ?微载体 聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体。大量繁殖 Cell line or Cell strain 的建立 基本概念 Cell line Cell strain Stock cells Continuous or infinite cell line or strain and immortality Finite cell line or strain 鉴定时间 连续传代10次左右 鉴定内容 细胞形态学 遗传学 酶学 分子生物学 建立cell line (strain) 的鉴定要求 形态学鉴定 细胞核型分析 细胞DNA指纹技术（DNA figer printing）检测 同工酶检查 抗原标记 细胞生长实验 建立cell line (strain) 的鉴定结论 美国ATCC（American Type Culture Collection）对细胞系的监测项目要求如下： ⑴组织来源和已传代数 ⑵明确细胞系组织来源是上皮细胞还是成纤维细胞 ⑶细胞系是否是正常细胞 ⑷培养条件及方法 ⑸细胞生长情况 ⑹细胞冻存与复苏 ⑺细胞生物等检测 ⑻细胞又无交叉污染 ⑼无菌检测 ⑽反转录酶的检测 ⑾注明细胞系建立者、检测者和鉴定组织 * * * * * * * * * * * * * * Cultural cell Biology 组织来源与培养 ?胚胎或成体组织来源 ◆来源于胚胎组织的培养物比成体组织更易生存和生长 ◆来自中胚层的细胞（成纤维细胞、内皮细胞、成肌细胞）比上皮细胞、神经细胞或内分泌细胞容易培养并且对血清中含有的有丝分裂因子敏感，易发生细胞的分裂增殖 ◆胚胎细胞不同于成体细胞，尚不能推测他们成熟