蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化干预作用机制研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2012 届博士研究生论文 PAGE PAGE 3 参考文献????????????????????????57 附录??????????????????????????64 致谢??????????????????????????65 略缩词表????????????????????????66 附：综述????????????????????????67 论文原创性声明?????????????????????80 蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化干预作用机制研究 病理学与病理生理学研究生：陆爽 导师：程明亮教授 摘 要 目的：1.探讨蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化的作用及肝组织γ-谷氨酰半胱氨 酸合成酶(γ-glutamate-cysteine ligase，γ-GCS)催化亚基（glutamate cysteine ligase catalytic, GCLC）表达的影响。2.探讨蓝莓对免疫性肝纤维化大鼠肝细胞凋亡及 葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated peotein78, GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋 白酶 12 (cystein-containing aspartate-specific protease 12, caspase-12)的影响。3.探 讨蓝莓对大鼠肝星状细胞系 HSC-T6 细胞凋亡及 Fas、Bcl-2、Bax 及半胱氨酸天 冬氨酸蛋白酶 3(cystein-containing aspartate-specific protease 3, caspase-3)表达的 影响。 方法：第一部分，60 只雄性 Wistar 大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模 型组、蓝莓原浆低、中、高剂量预防组及复方鳖甲软肝片预防组。除正常对照组 外，其余各组均采用猪血清复制大鼠肝纤维化模型，造模同时各预防组分别给予 蓝莓原浆（0.25ml/100g、0.5ml/100g、1.0ml/100g）及复方鳖甲软肝片（0.054g/100g） 灌胃，每日一次，共 12 周。行肝脏 HE、Masson 染色，透射电镜下观察肝组织 超 微 结 构 变 化 ； 计 算 大 鼠 肝 脏 指 数 ； 测 定 血 清 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 （ alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST） 水平；检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD)、丙二醛 （malondialdehyde，MDA)、羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）及 GSH 含量。实 时荧光定量 PCR、蛋白印迹法（western blotting）和免疫组织化学法检测大鼠肝 组织 GCLCmRNA 及蛋白的表达。 第二部分：采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling, TUNEL）及流式细胞术（膜 联蛋白/碘化丙啶双标记法，Annexin V/PI）检测上述各组大鼠肝细胞凋亡情况； 实时荧光定量 PCR、western blotting 及免疫组织化学法检测各组大鼠肝组织 GRP78 及 Caspase-12 mRNA 及蛋白的表达。 第三部分：采用血清药理学方法制备大鼠蓝莓血清、复方鳖甲软肝片血清及 生理盐水血清。HSC-T6 常规复苏培养后，分别加入 10%蓝莓低剂量、10%蓝莓 中剂量及 10%蓝莓高剂量血清干预，并设 10%复方鳖甲软肝片血清作为阳性对 照和 10%生理盐水血清对照。Annexin V/PI 双标记法检测各组 HSC-T6 的凋亡； western blotting 检测各组 HSC-T6 Fas 及 Caspase-3 的表达；免疫细胞化学及 western blotting 检测各组 HSC-T6 Bax 及 Bcl-2 蛋白的表达。 结果：第一部分，各组大鼠血清 ALT、AST 水平无明显差异；与正常对照 组比较，肝纤维化模型组大鼠肝脏指数明显增加（P0.05）；肝组织匀浆 SOD 活 性、GSH 含量明显下降（P0.05），MDA 及 Hyp 含量明显增高（P0.05）；HE、 Masson 染色及透射电镜观察显示有明显肝纤维化（P0.05）及超微结构病变； 肝组织 GCLCmRNA 和蛋白表达较正常对照组升高，但差异无统计学意义。与肝 纤维化模型组比较，各预防组大鼠肝脏指数明显减少（P0.05）；蓝莓原浆中、 高剂量及复方鳖甲软肝片预防组大鼠肝组织匀浆 SOD 活性、GSH 含量明显升高 （P0.05），M