立克次体分子生物学检测方法建立及云南红塔立克次体感染情况调查-病原生物学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：蒙明吞 签字日期：三!乙年』月卫日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保 留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关 部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。 敝作者签名：囊明春 指导教师签名： i窆童 签字日期： 迸年上月』日 立克次体分子生物学检测方法建立及云南红塔 立克次体分子生物学检测方法建立及云南红塔 立克次体感染情况调查 硕士研究生：栾明春 指导教师：唐 立教授 指导小组：俞东征教授 张丽娟教授 专业名称：病原生物学 摘 要 立克次体(Rickettsias)为原核细胞型、革兰染色阴性的专性细胞内 寄生菌。分类学属于变形纲立克次体目(Rickettsiales)，下属的立克次 体科包括立克次体属(Rickettsia)、恙虫病东方体属(Orientia tsutsugamushi)、埃立克体属(Ehrlichiea)。其中立克次体属又分为斑疹 伤寒群、斑点热群．自然界已发现有20余种对人类致病。近年新病种和 新疫区不断被发现，立克次体病已成为世界性关注的疾病。由于非特异 的临床表现，实验室诊断成为主要依据。目前PCR方法已被广泛用于立 克次体的实验室诊断，但多数方法只针对单个属或种特异，灵敏度往往 也达不到实际检测要求。为提供更快速、灵敏的检测方法，本研究以PCR 技术为基础，应用克隆、测序及序列分析等分子生物学、生物信息学手 段建立灵敏、特异地立克次体属和恙虫病东方体属多种属立克次体的检 测方法，并应用此方法对自然界鼠宿主、媒介生物、临床病人标。本进行 检测、产物测序、序列分析等研究。获得了以下结果： 1以PCR为基础的多种属立克次体检测方法建立 根据立克次体属和恙虫病东方体属热休克蛋白编码基因(groEL)的 保守区设计外引物，以文献属特异引物对为内引物组成巢式PCR。通过 产物片段大小、测序或PCR—RFLP鉴定不同属、种甚至不同型别立克次 体。特异性地扩增立克次体属和恙虫病东方体属立克次体DNA，每个反 应可检测到l×101拷贝数标准模板，比普通PCR灵敏度提高10倍。适 于地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、斑点热和恙虫病地同时检测。 2方法的应用 对从云南省玉溪市红塔区收集的各鼠肝脏、脾脏及部分鼠全血，鼠 蚤、螨及病人标本进行groEL基因巢式PCR检测。34．78％的鼠有阳性扩 蚤、螨及病人标本进行groEL基因巢式PCR检测。34．78％的鼠有阳性扩 增，斑疹伤寒、恙虫病和斑点热扩增阳性率分别为28．12％、19．13％、0．29％。 从蚤提取的DNA中扩增到斑疹伤寒片段，从螨提取的DNA中扩增到恙虫 病片段。8例可疑立克次体病病人血标本中，4例扩增出斑疹伤寒片段． 其中1例同时扩增出恙虫病片段。部分产物序列比较分析发现斑疹伤寒、 恙虫病和班点热片段序列分别与GeneBank中己知的莫氏立克次体 (R typhi)W、87·100、Ethiopian AZ322株，恙虫病(O．t)Karp型和西伯 利亚立克次体(R．sibirica)核苷酸和推定氨基酸同源性最高，多数100％同 _i骧，2l株斑疹伤寒和恙虫病产物核苷酸序列有碱基替换，呈99％同源， 其中7株推定的氨基酸序列有替换突变，呈99％，98％同源。问接免疫 荧光实验(Indirect fluorescent antibody test，IFA)鼠血清R typhi W株、 康氏立克次体(R．conorii)、O，Karp型、Kato型、Gilliam型抗体阳性 率分别为41．36％、31．82％、35．45％、31．36％、25．91％。从分子生物学和 血清学方面证实了红塔区有地方性斑疹伤寒、恙虫病及班点热的流行， 有地方性斑疹伤寒和恙虫病的核苷酸和氨基酸突变株存在。 各镇鼠标本地方性斑疹伤寒和恙虫病扩增阳性率均有显著性差异 (P(0．05)，血清R，typhi、0 t Karp型、Kato型IgG抗体阳性率也均有 显著性差异(P(0 0