卵母细胞体外成熟培养的分析-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

天津医科大学博士学位论文中文摘要 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 f研究背景：近20年来，辅助生育技术有了突飞猛进的发展，体外受 ～ 精、卵浆内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)和种植 前遗传学诊断技术的成熟标志着人类生殖医学进入了崭新的领域，但同时也 不能否认，在这一领域中还存在诸如妊娠率低、药物副作用和多胎率高等问 、 题。在助孕技术中普遍应用的卵巢促排卵方案，虽然可以使获卵率提高，但 在临床上也暴露出一些问题，如卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的发生、治疗费用高以及与远期发生卵 ?巢癌的可能关系等等，已引起人们的关注。卵母细胞体外成熟培养技术(in l ， 、 t r vitro maturation，IVM)是近年来研究的热点，它是在自然周期或使用少量 促性腺激素的周期，将不成熟的卵母细胞在体外培养成熟，进行体外受精和 胚胎移植，它克服了促排卵药物的副作用，是今后助孕技术发展的趋势之 ～ 一0 卵母细胞的成熟包括细胞核成熟和细胞浆成熟两部分，其中第一极体的 释放提示细胞核成熟的完成，而对细胞浆成熟的评价是在俸外受精后通过受 精和卵裂情况完成的。虽然未成熟卵经体外培养后细胞核成熟的比例在 60％、70％，但是受精率低，胚胎发育阻滞率高，囊胚形成率低，这提示体 。外成熟的卵母细胞存在着细胞浆成熟欠缺或核浆成熟不协调的问题，这是制 约IVM技术广泛应用的主要障碍。所以，继续深入认识卵母细胞的成熟规 律和改善体外成熟培养环境是当前的主要方向。 卵母细胞在体内的成熟过程是在促性腺激素的作用下在卵泡内完成的。 印泡是一个结构和功能单位，其中颗粒细胞是卵泡内主要的体细胞成分，它 介、导促性腺激素对卵母细胞的调节，同时通过自分泌或旁分泌作用，维持有 利于印母细胞成熟的微环境。在成熟培养体系中引入颗粒细胞的生长液能否 促进卵母细胞的完全成熟，尚未见研究报道。 天津医科大学博士学位论文皮质颗粒(cortical 天津医科大学博士学位论文 皮质颗粒(cortical granule，CG)是大多数哺乳动物卵母细胞所特有的 ～种细胞器，在卵母细胞的成熟过程中出现特征性的位置迁移，皮质颗粒向 胞膜下迁移，沿卵膜下呈线状排列，这是目前公认的哺乳动物卵母细胞成熟 最后阶段的一个共同特征。卵母细胞在成熟和受精过程中，细胞骨架发生～ 系列明显的变化，微管是一种重要的细胞骨架成分，对于哺乳动物g日母细胞 减数分裂的完成、精子的运动、雌雄原核的结合是必不可少的。在卵母细胞 体外成熟过程中，皮质颗粒和微管是否发生与细胞核成熟同步的变化，关系 到卵母细胞成熟后受精及卵裂的能力。目前研究体外成熟卵的皮质颗粒和微 ／ 管变化的文献所见不多。《 ／ 本研究分为两部分，第一部分主要在卵巢颗粒细胞原代培养的基础上， 研究颗粒细胞的分泌功能以及FSH、GnRHa对分泌功能的影响，其中颗粒 细胞的纯度鉴定、颗粒细胞分泌IGF—l和EGF以及GnRHa对颗粒细胞功能 影响的研究尚未见报道。第二部分研究颗粒细胞生长液等对卵母细胞体外成 熟以及进一步发育潜能的影响，其中在ⅣM培养体系中加入颗粒细胞生长 液尚未见文献报道。 ＼研究目的：1．研究成熟卵泡内的微环境；2．研究卵巢颗粒细胞的功能和 ＼ 调控；3．研究卵巢颗粒细胞生长液、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I，IGF— 1)对卵母细胞体外成熟和发育潜能的影响；4．以皮质颗粒和微管的特征性 分布研究不同的培养体系和培养时间对卵母细胞核浆成熟协调性的影响。 研究方法： 1．利用放免法检测13例接受体外受精患者卵泡液的雌二醇 (Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)和睾酮(Testosterone，T)的水 、F，利用免放法检测IGF．1，利用ELISA检测EGF；2．对16例接受体外受 清患者卵泡液中分离的卵巢颗粒细胞进行体外培养，利用免疫组化法和RT— PCR法检测颗粒细胞的FSHR的蛋白表达和mRNA的表达，鉴定体外培养 颗粒细胞的纯度；3．研究FSH(75mlU／m1)和GnRHa(100pg／mI)对体外 ．4． 天津医科大学博士学位论文培养颗粒细胞分泌E2、P、T、EGF和IGF．1的影响；4．使用3种体外成熟 天津医科大学博士学位论文 培养颗粒细胞分泌E2、P、T、EGF和IGF．1的影响；4．使用3种体外成熟 培养体系：对照组(FSH 75mIU／ml+E2 1riM)、生长因子组(FSH 75mIU／ml+E2 111M EGF in