利用转基因技术进行耐盐基因转化花生的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

汕头大学硕士学位论文 汕头大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 摘要 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题。据联合国环境组织报道全球约有 50 % 的耕地受到盐胁迫危害。我国也有大面积的盐碱地，仅海岸带、滩涂地就达一亿多 亩，并且有逐年增加的趋势。面对人口不断增加、耕地日趋减少和淡水资源严重不足的现 实，如何利用大面积的盐碱地和丰富的海水资源，这是人类迫切需要解决的重大课题。随 着生物技术的发展，人们寄希望于基因工程育种，即通过直接导入耐盐基因，使转基因作 物获得耐盐性，实现在盐碱地或海滩上用海水浇灌种植农作物的梦想。 本论文研究选用已在模式植物中证实能增强耐盐性的 mtlD（mannitol-1-phosphate dehydrogenase）基因及生长在海滩上的具有耐盐碱等特性的盐生植物-秋茄 (Kandelia candel L.Druce) 和海边月见草（Oenothera littaralis Schlect）的总 DNA 作为目的基 因，通过根癌农杆菌介导法和花粉管通道法转化优良栽培花生品种(Arachis hypogaea L. cv. Shanyou 523)，以期获得转基因耐盐花生。本研究是国内外首次进行单个耐盐基因和 盐生植物总 DNA 转化花生的研究。主要结果如下： 1. 建立了根癌农杆菌介导 mtLD 基因导入花生的遗传转化体系。整个遗传转化过程主 要分为预培养、共培养、诱芽、促芽、生根及移栽六个步骤。取萌发 7～8 d 的花 生叶片，切取中段为外植体，在诱芽培养基（MS＋0.8 mg/L NAA ＋3 mg/L 6-BA ＋2 mg/L AgNO3＋6 mg/L GLutamine ＋30 g/L Sucrose＋0.7 % Agar，pH 5.8） 上预培养 3 d,然后在农杆菌菌液中浸泡 5 min，放在诱芽培养基上共培养 2 d，再 用含有 500 mg/L 羧苄青霉素的无菌蒸馏水冲洗后，置于添加了 500 mg/L 羧苄青 霉素和 80 mg/L 新霉素的诱芽培养基上进行选择培养，直到长出幼芽(大约 5 w)。 转入添加了 500mg/L 羧苄青霉素和 80 mg/L 新霉素的促芽培养基（MS＋3 mg/L 6-BA＋2 mg/L AgNO3＋30 g/L Sucrose＋0.7 % Agar, pH 5.8）中培养， 3 w 后 将长出的小苗转移至生根培养基（ MS＋0.8 mg/L NAA＋2 mg/L AgNO3 ＋30 g/L Sucrose＋0.7 % Agar, pH 5.8），大约 2 w 后将长出强壮根系的植株移栽到沙土中。 2. 通过根癌农杆菌介导 mtlD 基因转化花生共获得 57 个再生植株。提取这些植株的 叶片 DNA 进行 PCR 反应，然后对 PCR 产物进行 Southern 杂交分析。结果有 3 株转 化植株在 PCR 反应中能产生 1.1 kb 大小的预期 DNA 片段，而且该片段可与 mtlD 3 基因探针进行特异性杂交，而阴性对照植株没有此预期 DNA 片段产生，表明 mtlD 基因已整合进花生基因组中。本次实验的转化率为 5.3 %。 3. 花粉管通道介导 mtlD 基因转化花生的研究。在 2001 年秋季获得“汕油 523”T0 代 转化植株共 29 株，PCR 检测到 2 株阳性植株，均为 100 μg/ml 的 DNA 处理浓度和 花萼管注射法处理，转化率为 5.9 %。由这 2 株阳性植株共繁殖了 22 株 T1 代植株， 提取它们的叶片 DNA 分别进行 PCR 反应，并对 PCR 产物进行 Southern 杂交分析的 结果，其中一株的后代（共 9 株）PCR 产物都没有产生预期大小的 DNA 片段，而另 一株的后代（共 13 株）中有 4 株在 PCR 反应中能产生 1.1 kb 大小的预期 DNA 片 段，而且该片段可与 mtlD 基因探针进行特异性杂交。进一步对这 4 株花生的后代 （T2 代，共 21 株）进行 PCR 检测，其中有 7 株呈阳性。这表明经花粉管通道介导 转化的 mtlD 基因已整合进花生基因组中，并已初步获得稳定遗传。转基因花生种 子（T2 代）在 140 mmol/L NaCl 溶液处理下的发芽率比对照提高 21.9 %。 4. 花粉管通道介导秋茄总 DNA 和海边月见草总 DNA 转化花生的研究。转基因花生种 子（T2 代）在 140 mmol/L NaCl 溶液处理下的发芽率有明显的提高。与对照相比， 转秋茄总 DNA 花生和转海边月见草总 DNA 花生的发芽率分别提高了 31.8 %、28.4 %。 关键词：花生，转基因，农杆菌，花粉管通道法，mtlD 基因，秋茄，海边月见草，耐盐 4 Abstrac